ラージスケール

質問

ラージスケールでDNAを回収したいのですが、回収量がものすごく少なく(最後にTEに溶かして保存するのですが、そのTE量が30μl程度)、回収したものを電気泳動で確認するとスメア状になってしまいバンドを確認することができません。ミニプレップの時はキレイにバンドが確認でき、それからラージスケールを行っています。
LB100mlに対して大腸菌培養液を1ml入れていました。その量が少ないのかと思い、先に10mlLBで培養したものを100mlに移して本培養しています(培養時間は17時間程度)。それでも回収量が多くなることがないし、電気泳動で確認してもうまくいっていません。
何か解決策があればお願いします。

回答No.4

joyjoyjo

酵母の遺伝子をもったプラスミドの回収という理解でよろしいでしょうか？
大腸菌にとっては外来遺伝子となるので、場合によっては生育等に不適切な遺伝子となることがあります。
この場合、大腸菌が十分に生育しなかったり、プラスミドを落としたりして、収量が少なくなることがあります。
この点は、ミニプレップで他のplasmidと同じような量が取れていれば問題ないかと思います。

スメアーになるというのが気になります。
DNaseの混入は大丈夫でしょうか？
この場合、プラスミドが切れていてスメアーになっていることを気にしてます。
また、solution IIを入れたときに、voltex等で激しく振ってないでしょうか？
この場合、ゲノムDNAが混入してスメアーになっていることを気にしてます。
あと、大腸菌は本当にDH5アルファでしょうか？

収量が少なければ、皆さん言うようにミニプレップの回数を増やすのも手です。
あと、思い切って500 ml位までスケールを上げて、最後はセシウムクロライドによる超遠心によって余計なもは全て落とすという手があります。
この場合、solution Iを入れたときに、10 mg/ml　リゾチーム(in solution I)を0.6 ml加えておきます。
どちらも手間がかかる力技となると思います。
一番楽なのは、キットを使って、プロトコール通りにやることです。