ゲルろ過の塩濃度について

質問

現在理系学部生四年で卒研の真っ最中です。分子量約50000のタンパクと約30000のタンパクをゲルろ過クロマトグラフィーで分けようとしました。バッファーはpH７のリン酸バッファーに0.3Mの塩をくわえたものです。しかし、ベースラインが無く、ピークを回収しSDS-PAGEで確認しても、わかれていません。そこで、塩濃度を0M にして再度おこないましたが、やはりわかれません。わかれないのは、分子量の差があまり無いからだと思います。
一般的に塩濃度を高くすると、タンパクはまとまってカラムから出てくるイメージがあるのですが、ゲルろ過における塩濃度の設定はどのような意味があるのでしょうか？教えてください。

回答No.3

noname#24872 · ベストアンサー

>塩濃度を高くすると、タンパクはまとまってカラムから出てくるイメージがある

これはイオン交換クロマトの場合ですね。ゲルろ過の場合には、タンパクの大きさで分けますから、極端に高塩濃度でない限り、Rf値にはあまり影響しません。

>ゲルろ過における塩濃度の設定はどのような意味があるのでしょうか

ゲルろ過におけるバッファーに含まれる塩には、タンパクの非特異的接着を抑制するという意味があります。弱いイオン結合で接着しているタンパク分子は、塩濃度を上げることで引き離すことができます。

ゲルろ過では、カラムを作ったらまず最初にマーカーを流して、カラム特性を把握しておくことが大切です。その上でサンプルが溶出される位置が分かれば、その後の戦略が立てやすくなります。

お礼

回答ありがとうございます。回収するたびに脱塩するのが面倒な塩の重要性がわかりました。イオン交換と同じように考えていました。もっとカラムの特性を勉強します。

回答No.2

panda_

ゲル濾過のゲルの粒子サイズは合っていますか？

分離したいタンパクのサイズが近くて分けられないなら、イオン交換クロマトを試す方法もあります。

お礼

ありがとうございます。ゲルろ過の粒子サイズとか考えたことがなかったです。イオン交換は試しましたが、うまくいきませんでした。私の基礎的な知識不足です。もっと勉強します。

回答No.1

geneticist12

塩を加えるのは、タンパク質とゲルとの相互作用（平たく言えば吸着）を防ぐためです。タンパク質とゲルが引きつけあうと、当然、分子量から期待される移動度より遅くなります。

30000と50000が分離できないのは
１．ゲルの持つ分画範囲からはずれている
２．カラムの長さが十分でない
３．カラムの長さに比べ、のせた試料の体積が大きすぎ
が考えられます。

お礼

ありがとうございました。大変ためになりました。もう一度考え直してみます。