A酵素を精製するための効果的精製手順(クロマト他)

質問

ある植物からすでに性質が明らかにされているA酵素を精製したい。まず、植物の抽出物(1000ｍL)を得た。この抽出物中にはB,C,Dという酵素も含まれている。A酵素は3回のカラムクロマトのステップで精製できる。A酵素を精製するための最も効果的精製手順を4項目の箇条書きにせよ。ただし、A,B,C,D酵素それぞれの性質は次のようである。
A酵素（等電点：5.6　分子質量：37ｋD　pH安定領域：pH5～8）
B酵素(等電点：4.8　分子質量：30ｋD　pH安定領域：pH4～７)
C酵素(等電点：5.9　分子質量：65ｋD　pH安定領域：pH5～8)
D酵素(等電点：9.0　分子質量：35ｋD　pH安定領域：pH7～10)

ゲルろ過クロマトグラフィーやイオン交換クロマトグラフィーを使うのだと私は思うのですが、ちょっとよくわからないのでわかる方がいましたらお願いします。
決してレポートとかではありませんし、どんな方法が一番有効なのか是非知りたいのでよろしくお願いします。

回答No.2

MIYD · ベストアンサー

おそらくA、B,C,Dはパラログで同じ基質を認識するという
設定なのだと思いますがそういう問題でしょうか。

問題として出たのならば
設定された性質の3つの酵素を除く操作が説明出来ていればいいのだと思います。

1　溶液のpHを8にしてBを失活させる
2　アフィニティークロマトグラフィーでBを除く

3　ゲルろ過でCを除く

4　イオン交換でDを除く
4' アフィニティークロマトグラフィーでpH5~6の範囲でAを失活させてカラムに結合しない画分を回収する

の四項目になると思いますが、
1-2,3,4の順番がどれがいいのかわかりません。

1-2のアフィニティークロマトグラフィーで
elutionに大量のリガンドを使うのであれば
1-2の後に3,4の操作をすることによりリガンドも除けるかもしれないので
1-2を最初に行うと思いますが、
3,4をどちらを先にやったほうがいいのかわかりません。
4'はボリュームが多くなるので4'をやるのならば4'→3になると思いますが、その後活性を戻せるかはこの問題の範囲外です。

実際に操作するのならばカラムクロマト3回などという条件は無いので

1 Aに特異的な抗体を作製する（もしくは買う）
2 その抗体で免疫沈降する
3 溶出する

でB,C,Dを除くことが出来ますし、

1 B,C,Dに特異的な阻害剤をいれてAのみの活性を調べる。

でも実験ができる場合もあるかと思います。

回答No.3

mizu_atsu

レポートではないとといいながら学校の過去門ですか・・・テスト対策ではないですか
なので本当に簡単にしか書きません。
陽イオン交換、陰イオン交換、ゲルろ過の3種を使えば精製できるのでは？
あとは透析するステップくらいかな。

回答No.1

nitscape

レポートでないのでしたら、答えは"わからない"でいいと思います。

A酵素が未知の酵素でとりあえず等電点、分子質量、pH安定領域が分かっているだけという状態でしたらレポート的に考えて等電点の近いCはゲルろ過で落とせるから最後はゲルろ過にして、Dはイオン交換で簡単に外せるし．．．のように決めていいと思います。

しかしAが性質が分かる既知のものですから、例えば強く結合するES複合体を得られ、反応が進まないSをカラムに固定してあげればカラム1本で簡単に精製できるかもしれません（強力に結合しすぎて遊離しないこともありますが）。担体が異なるだけでイオン交換でも遊離度合いが違ったりします。そのためイオン交換1発で十分な精製度を確保できてしまう可能性もあります。

実際の実験では酵素を100%分離することはまずできません。分離しても失活していたりすることがあります。分かっている性質と実際の実験結果や求めている精製度や収量、時間などを加味して精製を行います。回収率や精製度が低くてもいいのでしたら相当簡素化することもできます。極端なところ植物の抽出液そのものを精製せずに実験に用いてもいいこともあります。
そのような理由から"分からない"という結論になるわけです。

補足

以上の問題が過去に学校のテストに出ていたんです。
では箇条書きで４つ書くとしたら何を書くべきなのでしょうか。。。
pH安定領域の情報は特に加味しなくてよろしいのですか？