細胞増殖アッセイ MTT ASSAYなど

質問

よろしくお願いします。薬剤による細胞増殖の違いを見るアッセイを行いたいのですが、コラーゲンゲル内で培養している細胞なので困っています。最終的にASSAYの最終段階ではコラゲナーゼなどで溶かして細胞を単離したりするのは問題ないですが薬剤を効かせる段階ではゲルの中で行いたいのですが。MTT　ASSAYをはじめとして他にどのような系があるか教えていただきたいのですがよろしくお願いします、。

回答No.2

sfwaesr · ベストアンサー

おそらく、細胞をはがさなければいけないところが問題、ということですね？

MTTとほぼ同じ原理で、WST-1という試薬があります。この試薬はMTTと違い、細胞を溶解させる必要がありません。細胞を培養している100uLの培地にこの試薬を10uL加えて１時間程度まって、吸光度を測定するだけです。「加えて、待って、測定」だけです。
メリットは浮遊細胞でも容易にできるし、takkun35さんのように、特殊な環境でも使用できることです。
デメリットは、試薬がやや高めと言うことです。確か、ROCHEのもので、2500well分で2万から3万円の間だった気がします。自分でMTTの粉を溶かすよりは高いですが、MTTのキットに比べれば、それほどでもないと思います。

結果もMTTに比べ、細胞を溶解するところでのぶれがなくなるためか、 WST-1の方がかなり安定します。

なお、WST-1と似たもので、同仁（和光で取り扱い）からWST-8という試薬もでています。私の経験ではWST-1よりさらに安定した結果がでます。

takkun35さんの系は試薬を付加している時間を長めにとった方がよいかもしれません。

補足

詳しい解説ありがとうございます。　私の環境は　ゲル内に細胞を包埋したものをある期間いろいろな薬剤で処理しながら培養してそして薬剤ごとの増殖活性の違いと同時にできれば死んでいる細胞がどれくらいいるかということも観察したいのですが　ゲルのような厚みがある環境でも薬剤の違いが観察できるのでしょうか？　　ご多忙中申し訳ありませんがよろしくお願いします。

回答No.8

TCA

calcein とpropidium iodide の二重染色はいかがですか？
calcein-AM は生きている細胞の中で代謝されて緑色蛍光を示し、propidium iodide は死んでいる細胞の核が赤色蛍光で染色されます。蛍光プレートリーダーで測定することもできます。

参考URL：

http://dominoweb.dojindo.co.jp/goodsr5.nsf/View_Display/CS01

回答No.7

sfwaesr

細胞がはがせないようでしたら、TUNELなどを試してみてもよいと思います。コラーゲンの厚さがな点ですが、コンフォーカルを使えばOKです。あまりに厚いようでしたら包埋して薄切する手もあり、takkun35さんの系では組織と違うので難易度がかなり高いです。

FACSでのPIではアポトーシスに「向かっている」細胞、すなわち、まだ核構造が存在する細胞の測定はできると思いますが、完全に死滅した細胞をカウントする方法って難しい気がします。これはTUNELでも同じだと思います。

目的によって、どこで手を打つか、ということになるかと思います。薬剤によって死ぬことが促進されることをみる場合であれば、WSTによる細胞増殖カーブとTUNELによるDNAフラグメンテーションの存在を確認すればよいですし、もし、薬剤によって増殖が促進される場合にはWSTによる増殖カーブとshimuraushiroさんがご指摘されたBrdUによるDNA合成の促進をみればよいと思います。多くの場合、癌化した細胞ではアポトーシスと増殖の亢進が同時に起こっていることはなく、アポ or 増殖をみればよいと思います。

takkun35さん、がんばってください。

回答No.6

shimuraushiro

No5様
生細胞と死細胞はFACSで測定する直前にPI(プロピディウムイオダイド）を添加すれば区別できると思います。

回答No.5

sfwaesr

ゲルの中に包埋されている場合、試薬がアクセスしにくくなってしまい、通常より難しいかもしれませんが、低分子であるWST-1は移動できる気がします。ただ、通常より長めに試薬をかけておく必要があるかもしれません。WST-8であれば、細胞の個数に比例して目で見てもわかるくらい比色が変わってくるのでよいと思います。インキュベートの途中で何回か軽くシェイクしてもよいと思います。

あるいは、クリスタルバイオレットで細胞を染色し、紫色の細胞を直接カウントする手もありかと思います。

死細胞と生細胞を同時にカウントするのは難しいと思います。FACSを使う手もありますが、これも完全に壊れた細胞はカウントしにくいため、大変です。生細胞と死細胞を別々にカウントするしかないと思いますが、皆様いかがでしょうか？

回答No.4

fujishiro

私はコラーゲンコート上の培養細胞に対しWST法を用いました。

回答No.3

TCA

MTTと同じ原理の試薬ですが、私はalamar Blue(TM) という試薬を使っています。こちらも細胞の溶解は必要ありません。細胞を培養している培地に直接添加し、２～４時間培養してから570nmと600nmの吸光度、または530～560nmの励起光で590nmの蛍光を測定します。

回答No.1

shimuraushiro

RIが使える施設があれば細胞増殖アッセイは3H-thymidineを用いたものが一般的でしょう。RIが使えないのであればMTTに加えアラマーブルー、フローサイトメーターが使えるのであればBrDU,CFSE, PKH-26など細胞をラベルしたアッセイが可能です。試薬会社のカタログやHPを見るとやりかたが詳しく書いてあります。
がんばってください。