ＭＴＴアッセイ（検量線作成について）

質問

ＭＴＴアッセイを使い、細胞の増殖活性を調べています。
ＭＴＴアッセイ用のプレートとは別に、血球計算盤による細胞数測定用のプレートも用意し、同じ条件で培養した細胞を使って検量線を作成しようとしています。
ＭＴＴ発色時間は４時間で、この反応時間の間にもう一枚のプレートの細胞をはがして血球計算盤によるセルカウントを行いました。この細胞数と吸光度で検量線を引いてみたのですが、やはり違うプレート内のためか直線になりません。
またコンフルエントの細胞数をカバーするために濃いめに播種した点では、吸光度の値に変化がみられず、頭打ちになってしまいました。ＭＴＴ発色時間を短くして２時間で検討してみようと思っているのですが、ご助言いただけたらと思います。

回答No.1

Amakosan · ベストアンサー

まず発色時間についてですが、コンフの条件で吸光度がプラトーに達する前（経過時間と吸光度上昇がリニアな時間帯）を選択すべきと考えます。よって、2時間、4時間という区切りにこだわらず、まずはコンフの細胞で30分おきなど、経時的に吸光度測定して決定なさるのがよいのではないでしょうか。
また、検量線を作成することが目的であれば、コンフのwellを2*、4*・・・・blank と階段希釈するなどして、カウントした細胞数とMTTの吸光度のグラフを作成すればそれが検量線になるのではないでしょうか。ピペット操作等で幾分の死細胞は出るでしょうが、MTTはあまりセンシティブな系ではないので、剥離・希釈直後に試薬を添加して測定すれば殆どブレはないものと思います。
（細胞株によるかもしれませんが）

補足

解答ありがとうございました。
経験が浅く、また知識も十分にないため本当にご迷惑をおかけしますが、何卒ご教授お願いしたします。

発色時間については、Amakosanさまのご指摘にある通り、コンフルエントの状態の細胞で経時的に吸光度測定をしてみたいと思います。
実験方法をもう少し詳しく書きますと、24 well dishを使って細胞をディッシュの底に付着させたままＭＴＴ溶液を加え、マイクロプレートリーダーを使って吸光度の測定を行っております。
４wellずつ播種濃度を変えて細胞を播種し（播種濃度は５段階設定）、一晩接着するのを待ってＭＴＴアッセイを行います。
もう一枚のプレートにも同じように初期播種濃度を変えてまいておき、一晩待ってこちらは血球計算盤によるカウントを行います。同細胞を剥離してＭＴＴアッセイを行うとうまく発色せず、接着させたまま検量線が作成できればと思うのですが。やはりこの方法では難しいでしょうか。

回答No.2

Amakosan

参考になるかは解りませんが、私が以前同仁のCell Counting Kit-8で行った際は、測定前にwell中の液をプレートシェーカで攪拌（発色ムラがあるので）、吸光度については～0.9程度となる時点を採用（発色時間はは短ければ1時間程度）していた様です。
検量については、同仁のwebカタログにmethodが載っておりましたので、参考までに貼っておきました。（A450nm=1.5程度までリニアな様です）
あと、非常に基礎的なことになりますが、播種する細胞を調製する際メッシュを通してダマを取り除く、細胞を均一にまく（well中央に寄らない様に）、等、ちょっとした手技で改善されることもあるかもしれません。

参考URL：

http://dominoweb.dojindo.co.jp/goodsr5.nsf/View_Display/CK04?OpenDocument

お礼

遅くなりましたが、回答して頂き本当にありがとうございました。
現在まだ検討中ですが、いろいろ試してみたいと思います。
URLも大変参考になりました。ありがとうございました。