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ジスルフィド結合を多数（１５以上）持つ蛋白質をトリプシン消化しています

ジスルフィド結合を多数（１５以上）持つ蛋白質をトリプシン消化しています．しかし上手く消化がいきません（SDS-PAGEで未消化バンドを確認済みです）．そこで質問なのですが，ジスルフィド結合が多数存在し，酵素消化反応がいきにくい蛋白質を効率的に酵素消化する方法をお教えいただけないでしょうか？実際のプロトコール（in solution）でお教えいただけるとうれしいです．よろしくお願いします．

みんなの回答

  • ga111
  • ベストアンサー率26% (247/916)
回答No.2

もしかして、ターゲットのLys、Argがほとんどない蛋白ということはありませんか？Lys、Argが少しだけあっても何らかの理由で切れないこともあると思います。 還元剤＋変性剤はどうでしょう？　この同じ条件で他の蛋白（BSAなど）を使い、切れるというポジティブコントロールは取りましたか？ キモトリプシン、Proteinase　K　など、違うプロテアーゼで、切れるということは確認しておくといいかもしれません。

  • ga111
  • ベストアンサー率26% (247/916)
回答No.1

実際のプロトコールは知りませんけど、DTTでジスルフィド結合を還元してやったらどうでしょう？ 変性剤もいいかも。両方とも、消化前、消化中とかも検討します。

erizabess
質問者

お礼

ご助言いただいたように，変性剤，還元条件， アルキル化条件をいろいろ振りましたが， やはり良い結果がえられませんでした． とにもかくにも，ご助言ありがとうございました．

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