ポリクロナール抗体の濃度調整について

質問

はじめまして。
元々、工学系の人間なのですが、ひょんなことから抗体を使った実験を行うことになりました。ネットなどを調べて勉強しているのですが、抗体の濃度調整について分からないため、質問させていただきます。
今回、ポリクロナール抗体を使って実験するのですが、指定の濃度があり、40ppmに調整しなければなりません。ですが、使用するカタログ、データシートには50μlの容量の記載しかなく、メーカーに問い合わせても、明快な解答をいただけませんでした。
初歩的な質問で申し訳ありませんが、ご教示いただければと思います。

回答No.1

Dr_Hyper · ベストアンサー

まず、データーシートかカタログ、web siteからその抗体溶液が、血清なのか、protein A精製なのか、epitopeによるアフィニティ精製なのか、正確な状態をを知っておく必要があるでしょう。今回のご質問においては、単純には血清なのか、精製抗体なのかが重要ですが、一般にポリクローナル抗体を使用する際には、その精製方法も理解しておかないと、抗体価が１００倍ぐらい違う可能性があります。どうゆう実験に使われるかわかりませんが、目的のタンパク質を抗体によって回収する、吸着されるなどという実験では、目的のタンパク質に対する抗体がどの程度含まれているかが重要ですよね。ただポリクローナル抗体といって発売されている場合のほとんどは、その特異抗体の濃度は分からない場合が多いのです。
簡単にご説明すると、血清のなかに抗体が含まれています。ラビットであれば、その血清の中にある全部の抗体(この場合IgGですが)を精製するのにはProtein Aと言うタンパク質を結合させたビーズなどの担体を用います。この操作で精製できた抗体にはもちろん目的のポリクローナル抗体が含まれていますが、そのなかには動物が生きている間に獲得したさまざまな抗体が含まれているのです。一般に全部のIgGのなかに目的の抗体は数パーセント程度しか含まれていないと言われています。
つまり、血清をもちいて40ppmにするのと、proteinA精製の抗体を用いるのと、特異抗体のみを40ppmにするのでは、それぞれの間に数百倍以上の差があるのです。
最近の販売されている抗体の多くはprotein A精製した物が多いと思いますが、血清でうられている物もあるので注意が必要です。
私の想像ですが、血清で販売している会社に、「抗体の濃度を教えてください」といっても、「（精製してみて定量しないと）わかりません」
と回答されると思います。または精製抗体（proteinA)として販売されている物でも、その中にある特異抗体（目的の物を認識する抗体）は何マイクログラムありますか？と聞いても同じことで、ロットにもよりますし把握していないのが普通です。
この場合ご自身で精製するか抗体価をチャックするなどして計算しないと分からないと思います。

単純に40ppmに調整したいというのであれば、タンパク濃度を測定すればいいのですが、そのような試薬などがそろっていますかね？

お礼

回答、ありがとうございます。
根本的な部分からよく分かっていないため、皆さんにお手数をおかけしてしまいました。
現在、分かっている点ですが、
・血清ではなく精製抗体を用いる
ぐらいしか、お応えできません。皆さんからご指摘いただいた点を、調べてからまた質問させていただきます。

取り急ぎ、お礼まで。

回答No.2

otx

ポリクローナル抗体の溶液が50マイクロリットルあるのですね。
まず、40ppmに調整とは何をその濃度にしなければならないのでしょうか？

目的の抗体をでしょうか？または、すべての抗体をでしょうか？もしくはタンパク質量でしょうか？

そもそも、どのような抗体液を想定して40ppmに調整するように書かれたプロトコールかわかりませんので。。。

ポリクローナル抗体はいろいろな動物の体内で作られます。
そして、その動物の血液を採取してポリクローナル抗体は販売されるわけですが、
抗体溶液は販売される形態として、
１、血清
２、血清からそこに含まれるすべての抗体を精製し、
　　それらの抗体を含んだ緩衝液（バッファー）
３、抗体を作製するときに使った抗原に結合する抗体だけを精製し、
　　それらの抗体を含んだ緩衝液（バッファー）

およそ、このうちのどれかになると思います。

どれでしょうか？

１の血清とは
血を取ってからしばらくすると固まります。それを遠心してやると
赤血球とか細胞が沈殿するのですが、その上澄みの液です。
その上澄みには、もちろん抗体が含まれますが、その他の血液由来のタンパク質が沢山含まれます。
さらに、２の説明にもなるのですが、抗体といっても目的のタンパク質（抗原）に結合しない抗体も沢山含まれます。

２は血清中にある抗体を精製したものですが、抗体といっても目的のタンパク質（抗原）に結合しない抗体も沢山含まれます。

よって、１、２に関して、もしも「目的のタンパク質にのみ反応する抗体はどのくらいあるのか？」を知りたくても、
１、２の段階では誰にもわかりません。

３は、血清中にある抗体の中から、目的のタンパク質（もしくは抗原）に結合する抗体だけを（極力）精製したものです。
これならば、最終的に抗体濃度は明記してあるはずなのです。。。

最初にも言いましたが、目的のタンパク質（もしくは抗原）に対する抗体の濃度について「40ppmに調整しなければならない」というプロトコールだったら、濃度が明記してある（明記できるように精製してある）抗体を買う必要があると思います。