ランダムプライマーの使用量は？

質問

RT反応液調製のプロトコールに
ランダムプライマー（1.0μｇ）をtotal20μl系では0.5μl、total30μl系では0.75μl使用　となっているのですが、購入したランダムプライマーには　300μｇ（濃度3μｇ/μｌ）と記載がありました。
先輩はこの試薬を３倍希釈して（濃度が1μｇ/μｌになる）からプロトコール通りに使用していましたが、これでOKなんですか？

プロトコールのランダムプライマー（1.0μｇ）と先輩が調製した試薬（1μｇ/μｌ）は同じなの？？

プロトコールのランダムプライマーが濃度表記なら何の問題もなく使用できるんだけど・・・。

誰か教えてください。

回答No.4

otx

正直、わかりません。
一応、SuperScriptの一般的なプロトコールを添付します。
http://medgen.ugent.be/CMGG/protocols/cDNA%20synthesis%20using%20SuperScriptII.pdf

経験的に言うと、
目的のPCRがうまくいっているのであれば、
逆転写のプライマーの量は、ある意味適当で
うまくいっている＝適量
なわけです。
これ以上は他人がどうこう言うよりも
その先輩に聞いてみることが一番と思います。

今まで、その先輩の方法でうまくいっているのか？
そもそもこの質問をその先輩や先生にに聞いてみるとか。

回答No.3

noname#91223

仰る通り、プロトコル中のランダムプライマーの量の単位の表記が厳密ではないので推測するしかありませんね。

反応のfinal volumeの違いに応じて加える容量を変えていますから、この１．０μｇというのがチューブ１本に対して使用するランダムプライマーの総重量ではないことは確かです。従ってこれは濃度であるということになります。

次に問題になるのはその単位のスケールです。例えば1.0μｇ/Lなのか1.0μｇ/mlなのか1.0μｇ/μｌ判断する必要があります。どれが妥当かはＲＴ反応の一般的な他のプロトコルにおけるランダムプライマー（hexamer）の使用濃度を参考にすれば、容易に分かるのではないでしょうか。

回答No.2

otx

わかりました。すみません。

そもそも、

＞ランダムプライマー（1.0μｇ）をtotal20μl系では0.5μl、total30μl系では0.75μl使用

このところがよくわかりません。

プライマー量はグラムで表しながら、加える量はリットルで、

元々、そのプロトコールは誰かが手書きしたものであって
ランダムプライマー（1.0μｇ）というのはランダムプライマー（1μｇ/μｌ）のことを書きたかったんだけど、省略したか、

濃度がXμｇ/μｌのランダムプライマーの溶液を、0.5μl加えると反応益虫に1.0μｇが存在するように加えるえるというものなのか。

その先輩に確かめるしか、本当のところはわかりません。
この疑問を先輩に聞いてみてください。

お礼

http://www.mhlw.go.jp/topics/syokuchu/kanren/kanshi/dl/031105-1a.pdf
の８ページ目に表２.RT反応液調製液に記載の「Random Primer」の部分をご覧ください。
これを見た後再び回答いただければ幸いです。

回答No.1

otx

＞プロトコールのランダムプライマー（1.0μｇ）と先輩が調製した試薬（1μｇ/μｌ）は同じなの？？

濃度的には同じですけど・・・

＞プロトコールのランダムプライマーが濃度表記なら何の問題もなく使用できるんだけど・・・。

何が疑問か私にはよくわかりません。簡単に言うとどういうことですか？