• ベストアンサー

ノーザンブロッティングのプローブ

skc_yuichiの回答

回答No.1

現在DIGを使ったプラーク・ハイブリをやっており、後々DIGノザンを やろうと考えている者です。 DIGラベルDNAプローブでのノザンは私の周りでも結構失敗しているようです。 ロシュでもシグナルの強度、非特異的シグナルの抑制のためにRNAプローブ を推奨しているようです。 cerevisiaeさんが確認したいRNAの濃度がどれくらいか分からないので断言 はできませんが、お金に余裕があるならRNAプローブでやってみてはいかが でしょうか?(ちなみにうちには余裕がないのでDNAプローブでやらなければ いけないかも)

cerevisiae
質問者

お礼

アドバイス有難うございます。 DNAプローブでのノザンは大変そうですね。 ロシュがRNAプローブを推奨しているのは知りませんでした。 うちもお金は厳しいのですが、習いに行った先がRNAプローブ を使っていたので、そのまま導入することになったんです。 教えて下さった方は、簡単そうにやられていたのですが、 目で見るのとやるのでは大違いですね。 とりあえずはRNAプローブでがんばろうと思います。

関連するQ&A

  • ノーザン?サザン? ハイブリダイゼーション

    ハイブリダイゼーションの概要って、電気泳動で展開したDNAやRNAにプローブ(目印を付けた一本鎖)を取り付かせて、特定の塩基配列を見つけ出す技術・・・って事で良いんでしょうか? DNAを検出するのがサザンハイブリダイゼーション。 RNAを検出するのがノーザンハイブリダイゼーション。ですよね? 標的がRNAの場合。どうやってプローブをくっ付けるんでしょう?

  • 植物RNAを用いた非RIノーザン

    トマト葉からtotalRNAを抽出して遺伝子の発現をノーザン解析しています。 DIG標識したプローブを用いてケミルミで検出しようと試みていますが、全然うまくいきません。 バンドが何も出てきません。 感光時間を長くしたら、バックグランドが黒くなり過ぎてしまうのであまり解決にならないし・・・。 1レーン当たり10マイクログラム流していますが、それでも少ないのでしょうか? これだけの情報ではアドバイスにも困られるかと思いますが、何かノーザンで重要なポイントがありましたら教えて下さい。お願いします!

  • DNAプローブの作り方

    初めてサザン法を行い、またそれに使うDNAプローブをPCR産物から作るのですが、疑問があります。 (1)DNAを一本鎖にするために、熱変性し、キットを用いて標識するのは分かるのですが、それを氷上において一本鎖に保ちます。それを、ブロッティングしたメンブランにアプライするわけですが、いくら一本鎖にしたといえ、プローブ同士が二本鎖になることはないのでしょうか? (2)上記のようにPCR産物から作成したプローブはセンス鎖もアンチセンス鎖も混ざっているというわけですよね? (3)泳動した二本鎖DNAのゲルをアルカリ変性させ一本鎖にしますが、これをメンブランに移したということは同程度のバンドの位置に解離した二本鎖があるわけで、そこにプローブ(アンチセンス鎖もセンス鎖も含む)をアプライしたらバンドは二本観察されるのではないのでしょうか? 初心者的な質問で恐縮ですがよろしくお願いします。

  • ライゲーションの配列特異性について

    ライゲーションにおける配列の特異性についてです。 DNAセンス鎖に連続的にハイブリダイズする2つのアンチセンスプローブをハイブリダイズさせ,ライゲーションし2つのプローブを結合させることを考えています。 この場合,ライゲーションサイト以外の配列の特異性はライゲーションの効率にどの程度影響を及ぼすのでしょうか? また,それに関連して最低どの程度の長さのプローブをこの目的のためには用いるべきでしょうか? 何か参考になる文献,論文などが有りましたら併せて教えて頂けると助かります。

  • ノーザンブロットが・・・

    下垂体前葉細胞を培養して、mRNAを抽出、そのうちの1.5μgほどを泳動してノーザンブロットにかける実験をしています。 その際に成長ホルモンのバンドは出るのですが、normalizeするためのβ-actinのバンドがどうしても出てきません。 プローブのテンプレートがおかしいのかと思い、再度、大腸菌から切り出し、ラベルしてみたのですが、やはりダメでした。実験操作もGHのバンドが出てる以上、間違ってはいないと思っているのですが・・。 ちなみにプレハイ・ハイブリ・洗浄は60℃でやっています。「DNAプローブは42℃でハイブリさせる」と本に書いてあったのですが、やはりそのような温度でやるべきなのでしょうか?(テンプレートは100%muchです) どなたかこれじゃない?という理由のお心当りのある方、ご回答お願い致します!!

  • in situ probeの作り方

    in situ 用のRNA probe作製についての質問です。 現在行っているprobe作製の手順ですが、 (1)SP6およびT7の配列を組み込んだPCR primerを使って、目的の配列とpolymeraseの配列を含んだPCR産物を得ます。 (2)このPCR産物をin vitro transcriptionのtempleteとして用い、RNAを合成します。 (3)RNA columnにより精製し、最後にgel上でバンドの確認をします。 この最後のgel上での確認の際、バンドが2本見えます。1本は目的のサイズです。スメアではないのでRNAが分解したものではないと思います。 DNAのコンタミかと考え、in vitro transcriptionの試薬を新しくし、再試行しましたが、同じ結果となりました。 どのようにしたらこの問題を解消できるのでしょうか。 in vitro transcriptionの前にgel extractionによりPCR産物は精製しているので、全く異なる配列のRNA産物ではないと思うのですが、このままin situに使えますか? もし、シグナルが得られても結果に自信が持てない気もしますが。。 よろしくお願いします。

  • ハイブリダイゼーションとアニール

    どちらも1本鎖DNAが2本鎖のDNAになることだと思いますが、違いがわかりません。ハイブリダイゼーションは異種のDNAまたはRNAと相補的結合を行うことで、アニールは同種のDNA同士で再結合することでしょうか?プライマーなどはアニールするといい、プローブはハイブリですよね。今一違いがわかりません。

  • DNAとRNAのどのような性質に違いから水溶性になるのか,脂溶性になるのかがわかりません.

    大学の実験でノーザンハイブリダイゼーションをやったのですが,核酸を抽出するときにDNAとRNAで抽出に必要なpH条件が異なる原因がわかりませんでした. 具体的には,それぞれの核酸抽出用の生体試料に試薬を加えて遠心すると,DNA抽出ではpH9の下で上清にDNAが含まれ,RNA抽出ではpH4の下で上清にRNA,有機層にDNAが含まれる,ということです. ウェブで色々調べたのですが,「DNAはアルカリ性で,RNAは酸性の水溶液で水溶性になる」ということだけがわかり,具体的に「どのような化学的性質の違いにより,溶け方の違いが生じるのか」ということはわかりませんでした. また,DNA抽出では上清にRNAも含まれている気がするのですが,RNAははいっているのでしょうか?また,入っているとして,ハイブリの結果に影響はないのでしょうか? どなたかこの辺の事に詳しい方,教えてください.お願いします.

  • ノーザンブロッティングとは?

    ちょっと困ってます。もってる資料が少なすぎて&専門用語が理解不能でノーザンブロッティングがいまいちよくわかりません。教えてください。もしくは詳しく(わかりやすく)説明してくれているサイトを紹介してくださいm(_ _)m

  • RNAの電気泳動について質問です。

    現在、テンプレートのDNA(長さは197bpです。)からT7ポリメラーゼ酵素を用いてRNAを合成し、精製したRNAの長さを電気泳動によって確認するという作業を行っているのですが、予測される目的RNAの長さは132塩基なのですが、実際のバンドは250塩基付近の辺りに単一バンドが出ました。RNAがヘアピン構造を取ると、自身の長さのバンドよりも早く流れるというのは経験済みですが、大きくなったのは始めてです。これは精製したRNA同士で多量体を形成しているおそれがあるという解釈でよろしいのでしょうか? また、ウチの研究施設には、RNA用のマーカーや試薬がないために、DNAと同様に1×TAEバッファーでアガロースゲルの電気泳動を行いました。マーカーもDNA用のものを用いているので、あまりマーカーは当てにしなくてもいいのでしょうか? あと、RNAを泳動する際に、1本鎖で流れるようにするテクニックとかありますか?これまでは、RNAを泳動前に95℃で10分ほど熱を加えてから泳動を行っていました。 ヒントでもいいので、ご教授お願いします。