DNAのハイブリダイゼーション条件について

質問

63bpのdsDNAをssDNAとして精製しました。
PerfectMatchとNCの2種類の63merのオリゴDNAに対して、ハイブリダイゼーションを行い、dsDNAの形成するorしないを確認したいと思っています。

確認の前段階として、2つのDNAをハイブリさせなければなりません。
ハイブリダイゼーションの温度はTmよりも5～20度低い温度で行うと聞きましたが、
ハイブリダイゼーションのバッファーはどうしたらいいのでしょうか？

50%Formamide,10mMリン酸バッファーpH7.0や100mM KCl,100mM Tris-HClpH7.4,2mM MgCl2などの例がありましたが、
FormamideやMaCl2を入れる理由がわかりません。

2つの質問になりますが、ご存知の方教えていただけると幸いです。

回答No.2

geneticist12 · ベストアンサー

Formamideを使うと、低い温度でハイブリができるので、目的に応じて、ターゲットを高温にさらしたくないとき、あるいは全くの実験者の好みで、DNA/RNA ブロットハイブリやin situ ハイブリのとき使われます。

特別の考えがないのであれば、formamideなしの系でいいのではないでしょうか。

おそらく、
>50%Formamide,10mMリン酸バッファーpH7.0
は、塩濃度が低く50% formamideを含むので、かなりアニールしにくいとみました。

＞100mM KCl,100mM Tris-HClpH7.4,2mM MgCl2
これは、ほとんどTaq polのバッファーですね。
理論式で計算するとTm75℃前後になるでしょうか。

Molecular CloningにはオリゴDNAの鎖長、GC%、塩濃度からTmを計算する理論式も出ていますから、塩濃度と温度が妥当な条件を選んでみたらいいと思います。

補足

特に低温条件を必要としないので、Formamideなしの系で検討したいと思います。

確かにPCRバッファーはアニールさせることを前提としているので、この系で行えば無難なのかもしれません。

＞100mM KCl,100mM Tris-HClpH7.4,2mM MgCl2
＞これは、ほとんどTaq polのバッファーですね。
＞理論式で計算するとTm75℃前後になるでしょうか。

これはgeneticist12さんが塩濃度と63bpから計算したTmという意味でしょうか？

回答No.1

geneticist12

formamideはTmを下げる働きがあります。1% formamideにつき0.6℃ Tmが下がるといわれています。また、formamideはハイブリの速度を遅くします。（Molecular Cloning参照）。
たとえば、サザンブロットで5xSSCで68℃が適当であるところ、formamideを50%加えると、42℃が至適になります。

Mg++は、duplexを安定化します。PCRのときMgCl2の濃度を振ったりするのは、プライマーのアニール、ミスアニールの安定性をコントロールするためです。

その実験で、ハイブリさせるといっているのは、ブロットに対してでしょうか、それとも溶液中ででしょうか。溶液中でduplexを作るときは、formamideを加えるのはあまり一般的ではないように思いますが。

補足

回答ありがとうございます！
formamideには、そのような効果があるのですか！
Molecular Cloningを参照してみます。

この実験では溶液中でハイブリさせようと考えています。
Tmが特別高くない限りはFormamideを加える必要はないのでしょうか？