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モノクローナル抗体とポリクローナル抗体
はじめまして、とても困っているのでよろしくお願いします。 私はある蛋白の抗原決定基を調べるために、酵素で分解しながら市販のモノクローナル抗体を用いてイムノブロットを繰り返し行い、ある程度絞れたら（小さい断片になったところで）アミノ酸シーケンスを行なう予定でいます。そこで質問です。 質問：ある蛋白ｘが抗原決定基を一つ以上持つ場合（たとえば三ヶ所）、モノクローナル抗体ではこのうちの一ヶ所にしか反応しないということでいいんでしょうか？ また、三ヶ所のうちどれに反応するかはモノクローナル抗体次第ということでしょうか？逆に動物に免疫したポリクローナル抗体では三ヶ所それぞれに反応する抗体が存在し得るということなんでしょうか？ また大きなタンパク質になるほど抗原決定基は増えると考えていいんでしょうか？ なんだか支離滅裂な文章で申し訳ありませんがよろしくお願いします。
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「市販のモノクローナル抗体」とあったものについてですが、その抗体に関する参考文献は網羅されているのでしょうか？ 今お使いのモノクローナル抗体では、詳細な認識アミノ酸配列について述べられている資料はあるのでしょうか？ 中にはもちろんどういった部分を認識しているか（アミノ酸配列だけでなく、その部分のリン酸化等による修飾形態等によっても結合が左右されるため）が分からないものも、市販の抗体には当然存在します。 koolashさんが行っておられる実験は、このような認識部位不明のモノクローナル抗体について、それが認識している具体的なアミノ酸配列について追求されておられるのでしょうか？ そうなると、話は別になってきますが、モノクローナル抗体やポリクローナル抗体に関する抗原認識の機構は先のすべての回答に要約されています。 具体的にどういった目的でそのモノクローナル抗体を使用されているのか、そのモノクローナル抗体についてのペーパーでその抗体の性質がどの程度まで解明されているのか、が分かれば早いのですが、なにせ研究ですので詳細は明かせなくて当たり前ですよね。 モノクローナル抗体も、アミノ酸の一次構造のみを単純に認識しているわけでもなく、その配列内における修飾状況、またそれに付随した立体構造の変化により反応性は変わってしまいます（私もやっかいな抗体を扱っていた経験があり、過去にこのサイトでえんえんと他の回答者の方々に相談にのっていただきました。気の遠くなるような討論ですが、参考URLを一度見てみてください）。 この質問内容のみでしたら、一般的な抗体の性質の言及のみに留まってしまいますので、koolashさんの求めていらっしゃる回答にならないのかも知れませんね。一応、モノクローナル抗体についての過去の質問の紹介もしておきます。でもakiyamaharukaさんのご紹介されたURLの方が参考になるでしょうね…。http://oshiete1.goo.ne.jp/kotaeru.php3?q=156226） そういった訳ですので、koolashさんが今困っていらっしゃる点について、もう少し補足可能なようでしたら、まだ私を含め他の専門家の方々の助言がいただけるかも知れません。 もしまだどこか引っ掛かることがあるようでしたら、新たにご質問されるか、補足にてお知らせください。
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- sonorin
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市販のモノクローナル抗体をお使いと言うことは、そのモノクローナル抗体が認識するアミノ酸配列が明らかのはずですよね。 検討されている蛋白をどの程度の長さまで切断されるのか分かりませんが、もしその蛋白の中でモノクローナル抗体がクロスリアクションを起こしやすい程度の非常に酷似している配列を有している場合で、その部分が酵素によって途中で寸断されることなく切断された場合は、そのウェスタンブロッティングで複数のバンドが検出されてしまう可能性はあります。 しかし、そういったケースは私自身それほど多岐の分野にわたるペーパーをチェックしている訳ではありませんが、見かけたことはありません。 モノクローナル抗体はものによってそれぞれですが、短いアミノ酸配列（10個以下）では、ひょっとするとあり得るのかも知れません。ですが、ターゲットに厳密に反応するように作製されているはずですから、あまり経験しないのでしょう。 ポリクローナル抗体は、（おわかりでしょうけど）色々な配列部分を認識する様々な抗体が混在するものです。その抗原決定基は重複する場合、あるいは一つの抗体認識部位の全体を覆うような配列部分を認識する場合等がもちろんあります。当然、配列が長くなればなるほど、それだけ抗体が産生されうる抗原決定基の種類（言い方は少し不適当な気もするのですが）も増えるでしょう。 どこまで蛋白の大きさを絞り込むのか分かりませんが、一度壁にぶち当たるまでトライしてみてからまた同一蛋白の他の抗原決定基を認識するモノクローナル（あるいはポリクローナル）抗体での反応をチェックするといった感じでもいいとは思います。 私も支離滅裂な回答になりましたが、どうでしょう？
＞ある蛋白ｘが抗原決定基を一つ以上持つ場合（たとえば三ヶ所）、モノクローナル抗体ではこのうちの一ヶ所にしか反応しないということでいいんでしょうか？ その一つにしか反応しない抗体のみを産生する細胞からとったものがモノクロですからそうなります。ただし、繰り返し配列があり、同じ部位を２カ所以上持てばすべてで反応します。 ＞三ヶ所のうちどれに反応するかはモノクローナル抗体次第ということでしょうか？ どこが抗原決定基かどうかで決まるわけですから。 ＞逆に動物に免疫したポリクローナル抗体では三ヶ所それぞれに反応する抗体が存在し得るということなんでしょうか？ そういうことです。しかし部位によってエピトープになりやすさが違うのでポピュレーションの割合が同じではありません。 例えば、免沈できる場所のもの、免染しやすい場所のもの、ウエスタンにはすごく強いものとあるわけです。これは免液の度に違うものができるわけです。 ここでいう、抗体ができにくいエピトープだとしても、 モノクロならばそれがとれれば後は増やせばいいから強いわけです。 ただし手間はかかります。 またモノクロでは、生物種が違う場合、異種でエピトープの配列が違うと認識しないということがおこるわけです。その点どこかに同じエピトープがあればよいモノクロは強いですよね。またエピトープが糖を含む場合、ネイティブには反応するがリコンビナントではさっぱりなんてこともあります。 すこし話がそれましたが、モノクロの作り方の理解が少々不足と感じます。 お勉強がんばってください。 参考ページでちょうど３つのエピトープの話で説明があります。
- ADEMU
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モノクローナル抗体は抗原の特異性を高めたもので抗原の特長を最小限のアミノ酸で認識しています。 ポリクローナル抗体は抗原の類似性を認識できず特異性が低く、アミノ酸を幅広く認識しています。 質問にある蛋白は抗原決定基を複数持っていますが、モノクローナル抗体は当然１ヶ所認識します。サンドイッチ法では異なった２種類のモノクローナルを使用します。もし３ヶ所あるとすればその３ヶ所のうちその蛋白をより特異性の高いものにする部位を選べばモノクローナル抗体として試薬として使用できます。 ポリクローナル抗体は認識できるアミノ酸が幅広いため分子量の少ないものはあまり特異性が高くありません。３ヶ所それぞれといういみではなく、３ヶ所の抗原決定基をそれぞれ幅広く認識しているということでそのアミノ酸に類似したものをみんなつかまえてしまうということです。 蛋白質が大きくなるにつれ抗原決定基は増えますが、反対に類似性をもつものも増えると思います。 なんだか支離滅裂な答えになってしまいました。 ご理解いただけたでしょうか。
あまり、詳しくありませんので 間違っていたら、ごめんなさい。 でも、正しいと信じて回答します。 モノクローナル抗体のクロスリアクションも 関係有るのでこれがないと考えると モノクローナル抗体は1つの抗原決定基しか認識 しないはずです。でも、抗原蛋白には、同じ抗原決定基が いくつも存在する蛋白もあるかもしれません。 動物に免疫したポリクロでは、かなりの確率で3つの抗原 決定基に反応する抗血清が取れると思います。 分子量が小さいと抗原性が低いですから、 大きな蛋白ほど抗原決定基が増えるという考え方は ある意味で正しいのではないかと思います。 答えになっているかどうか判りませんが 素人なりに回答させてもらいました。
補足
>市販のモノクローナル抗体をお使いと言うことは、そのモノクローナル抗体が認識するアミノ酸配列が明らかのはずですよね。 ということなんですが、これは合成ペプチドを抗原としてモノクローナル抗体を作ったということですか？ 使用しているモノクローナル抗体はakiyamaharukaさんの参考URLにあるような方法で作られたものだと思うのですが、このような方法で作られた抗体でも認識するアミノ酸配列はわかっているんでしょうか？ 度々申し訳ありませんが、教えてください。