HPLCカラムの洗浄方法

質問

逆相のカラムは使用後に必ず水で洗浄した上で、適当な水：溶媒系に置換するものだと思っていたのですが、今私が勤務しているところでは、誰も水で洗いません。ていうか、50％アセトニトリルを流すことを「洗浄」と称しています。実際、これでいいんですかね？

回答No.8

bunsekiya · ベストアンサー

＃６です。お恥ずかしい限りです。
おっしゃる通り、「水：メタノール＝９：１」の間違いです。別の分析条件でよく使っていたのでついつい・・・。

それから、＃７さんの回答でもうひとつ思い出しました。どのようなバッファーだったかは忘れましたが、移動相をメンブランフィルターに通してからでないと使えないものがありました。

brassardさんの直面している条件で有効かどうかわかりませんが、予防の意味で一度試してみては？

既に同様の処置を済ませた上でのご質問でしたらご容赦下さい。

お礼

やっぱりそうですよねえ。
いえいえ、誰にでもうっかりはあるもんです（笑）。

今回は大変勉強になりました。
bunsekiyaさんをはじめ、ご回答いただいた皆さんに心より御礼申し上げます。

回答No.7

mizu_atsu

＞１～２回の分析でカラムの分離が悪くなって使えなくなる試験があるんですよ。移動相が怪しいんだってみんな言ってるんですが、リン酸buffer：アセトニトリルの系なんですよ。全然あやしくないでしょ？

まさにそのような移動相を使ってました。
1～2回ということはありませんが、サンプルを30個ほど流したあとはほぼ確実にピークがラダーになるという現象が起きました（特に何回か洗浄を繰り返したカラム）。
このときの対処としては「カラムを逆につけ、5分ほど移動層を逆流させる」そして元通り付け直して使用する。
これでダメなときはまた逆につけて純水を逆に5分流し、元通りにつけて移動相置換、30分程流して平衡化した後に使用する。
ということをやっていました。
なんだが使っているうちに塩が（入り口に）たまっているのでは？ということで詰まった塩を除去するためと聞いた気がします。
このため、私は使う前に必ず逆に5分流してから正規に取り付けて使用していました。これだとなぜか60サンプルくらいは普通に分析できていました。
分析途中でやっているとかなり時間を食うので。
（カラムの温度も下がってしまうのでその平衡化にも時間がかかる）
ただ、この方法が本当に良いかどうかは定かではありませんが。。。

お礼

そんな手もあるのですね。トラブった時の選択肢のひとつに加えておきます。ありがとうございました。

回答No.6

bunsekiya

懐かしい問題ですね。以前、とある企業の分析研究室で10年間ほど勤めておりました。

まず、ＯＤＳなどの逆相系カラムを水１００％で洗浄することはカラムメーカーなどに聞いてもあまりお薦めされません。バッファーを洗い流すためには水：メタノール＝１：９のようなものを用いることを薦められます。

なぜかと言いますと、水１００％の移動相を流しますと、疎水性であるオクタデシルシリル基のアルキルチェーン同士がペチャッとくっついてしまい、洗浄効率が悪くなってしまうのです。

なので、アルキルチェーンが展開したまま洗浄でき、塩が溶けきれずに析出することがないであろう水：メタノール＝１：９あたりを使用するのです。

ちなみに、私が分析に携わっていた頃のサンプルは香料や油成分も多かったため、

水：メタノール＝１：９で塩を洗い流す
　　↓
ＩＰＡ１００％で油性成分を洗い流す
　　↓
水：メタノール＝１：１で保管

でした。サンプルに含まれる夾雑物を考えて洗浄方法を組み立てることが重要です。そうしないとゴーストピークが大事なピークにかぶってしまったりして泣きを見ます。

どちらかと言うと、１～２回でカラムをダメにしてしまう分析条件とサンプルの方に興味がありますね。

ちなみに、現在は水１００％でも高極性成分を分析できるカラムが出てますので、そういうカラムの洗浄には水１００％が使えるかもしれません。

お礼

ほお。。。非常に論理的なご解説ありがとうございます。なるほどなるほどと思ってしまいました。
ところで、水：メタ＝１：９ですか？９：１ではなくて？

回答No.5

yuyu2003

No.4で答えた者です。
100％水や100％有機溶媒が必ずしも悪いということはないとおもいますが、私の経験では使用したことはありません。詳しい原理についてはあまり覚えていないのですが、100%にした後に有機溶媒なりを混合させたときに気泡が発生する危険を避けるためとか、基材に悪いとか、という理由もあったような...自信なしです(笑)でも、カラムの洗浄で100%有機溶媒が推奨されることがあっても水というのは見かけたことはないです。
カラムの種類や使用条件によって効果的な洗浄方法は異なってきますから、お使いのカラムの具体的な洗浄方法はカラムメーカーに問い合わせるのが最良かと思います。

ところで、「リン酸buffer：アセトニトリルの系」は当然ですがその比率次第では塩が析出する場合があります。特に初めて使用するカラムは有機溶媒濃度が高い状態で出荷されていますから、急に溶離液を流すと析出しやすいです。もしカラム圧が上昇もみられるのであれば、この辺に原因はありませんか？またリン酸bufferは腐敗しやすいので、もし移動相の調製でbufferを前もって作り置きしているようなことがあると、細菌が繁殖してしまっているかもしれません。
HPLCのトラブルについてこの場でお答えするには限界がありますので、(試験方法の変更も含めて)色々探ってみてください。

お礼

再度のご回答ありがとうございます。参考にさせていただきます。

回答No.4

yuyu2003

逆相系のカラムでは100％水や100％有機溶媒という洗浄はあまりしないと思います。溶離液にバッファーを混ぜて使っていたとしたら、洗浄は「純水＋有機溶媒」で行います（比率は系によると思います）。ですから、ご勤務先で行っていることは、問題が起こっていないのなら別に間違ってはいないと思いますよ。

お礼

そうなんですか？
もしご存知なら、その理由というか理論というか根拠というか、そんなのを教えていただけませんか？
ところで問題なんですがね、１～２回の分析でカラムの分離が悪くなって使えなくなる試験があるんですよ。移動相が怪しいんだってみんな言ってるんですが、リン酸buffer：アセトニトリルの系なんですよ。全然あやしくないでしょ？
やっぱり水で洗わないからじゃないのぉ？って個人的には思ってるんですけどね。

回答No.3

mizu_atsu

私のところでは
メタノールに置換して保存（例え一晩でも）
↓
純水で置換
↓
移動層（バッファーとアセトニトリル）で置換
↓
使用
↓
純水で洗浄
↓
メタノールで洗浄し保存

のようにしていました。
水を流すのはバッファーを流すためと教わりました。
なぜならバッファー成分がメタノールと反応して塩ができるからです。
メタノールを流す理由ははっきり聞いていませんがその方がカラムが安定しているのではないかと思います。HPLCではありませんがエタノールで保存するカラムもありましたから。
あとはカラムに不純物が強固に結合している場合に有機溶媒で洗い流すという意味もあるように思います。

お礼

結構、場所によっていろんな流儀があるもんですねえ。
不純物を洗い流したいときには、塩化メチレンとかＴＨＦとか、体に悪そうな強力なのを使う人もいますよね。

回答No.2

Kemi33

#1 さんに追加で・・・。

　測定化合物が水：アセトニトリル（１：１）で溶けても，溶離液にバッファーを使用している場合には水による洗浄が必要です。バッファー成分を洗い流すために。

お礼

そうそう、やっぱりそうですよねぇ？
私もそう思ってるんですよ。
う～ん・・・、他の方の意見も伺ってみます。

回答No.1

70633

カラムの中に残った測定物を押し出せばよいのであって、測定物が溶解する液を流しておけばよいのではないかなぁ。

水に溶けない物質を水で洗っても意味が無いような気がしますが。

お礼

えっと・・・逆相ですので、移動相中の界面活性剤やら塩やらを水でさっぱり洗うという意味なんですが。