DNAの塩基配列を決定するシーケンスについて

質問

シーケンスについての質問です。
サンプル調整をする際に、クローニングに用いたプライマーを
使ったのですが、ほとんど配列が読めていませんでした。
もしかしたら、市販で売ってるプライマー（ベクターのマルチ
クローニングサイトの前にくっつくプライマー）を使った方が
正しく配列を読めるのでしょうか？
ちなみにキャピラリーシーケンサーを使っており、Bigdye-
terminatorのキットを使っています。
わかる人がいれば教えてください。

回答No.2

miya_0726

シーケンサーの出力する波形は確認しましたか？

最初にピークがどかっと出て、その後なにもピークが出ていないような場合は、テンプレート量が少ない、プライマーが張り付いていない、インサートがまったく違う配列であったなどの理由が考えられます。
BigDyeやプライマーの量をやみくもに変更すべきではなく、まずは鋳型量、プライマー量など全てキットの推奨どおりにしてやってみるべきだと思います。プラスミドシーケンスは、PCR産物のダイレクトシーケンスよりも必要テンプレート量が多いのですがそれは考慮していますか？
また、いわゆるシーケンスベクターに載せている場合などは、シーケンスプライマーを用いた方がTMやGC contentの点で有利です。シーケンスに用いた増幅用プライマーが、BigDyeのサイクルシーケンス反応に適合していない可能性も考えられます。（過去似たようなことをやったこともありますが、読めないということは無かったですが・・・）

２度やって読めなかったのであれば、まずベクター側に貼りつくシーケンスプライマーでの解読を試みるのがよいかと思います。プラスミド及びインサートの長さに問題はありませんか？デリーションなどを起こしていたりすると増幅用プライマーでは解読できないこともあります。

あとは・・・、シーケンスのためのプラスミド回収にQIAGEN plasmid Midi Kitなどのカラムキットを用いていませんか？これらのカラムからの溶出バッファーは高濃度の塩を含んでおり、この塩の除去が不完全だとサイクルシーケンス反応がうまくいかないことが知られています。一度エタノール沈殿などで精製してみるのもよいかもしれません。

お礼

ありがとうございます。シーケンサーの波形をみると、
確かに最初だけドンとシグナルがでてて、あとは急に
シグナルが弱くなっています。
またシーケンスをやり直そうと思いますが、シーケンスが
できるプラスミド抽出キットを使い、プライマーはベクターに
くっつく物を使おうと思います。プライマー量などは
従来のプロトコール通りしようと思います。
ところでみなさんは、シーケンスする際のプラスミド抽出キットや、
シーケンスのサンプル調整に使う試薬(Big-dye terminatorなど)
はどのような物(メーカーなど)を使っていますか？
支障がなければ教えてください。

回答No.1

rouxkt

どっちでも読めると思います。

何度かくり返してみてはいかがでしょうか？

また、キャピラリーの使用回数の確認や、ゲル・バッファーの量などを確認してみてはいかがでしょうか？

また、最後に使用した日から結構時間がたっていたりする場合、フィルキャピラリーなどをして見るのもいいかもしれません。

お礼

ご回答ありがとうございます！！
どちらのプライマーでも読めるのですね。
２回繰り返してやったのですが、結果は同じでした。
プライマーやテンプレートや、bigdye-terminatorの
量を倍にしてもだめでした。
なぜきれいに読めないのか原因がわからず苦労してます。