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抗体の処理
ウエスタンで使用する目的で 大腸菌で目的タンパクを作らせ、精製後 抗体作成を業者に依頼しました。 出来上がってきた抗体を使って 目的タンパクを誘導させた大腸菌の urea抽出タンパクを使ってウエスタンしたところ 目的のバンド以外にも多数バンドが出ました。 こういったときにベクターのみを入れた 同じ大腸菌のタンパクを抗体に前処理しておくことで 非特異性バンドをある程度消すことができることを 聞いたのですが、具体的な操作がわかりません 混ぜる量や、その後の大腸菌タンパクの除去などに ついて詳しく教えていただけないでしょうか？ よろしくお願いします
- kshimo
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質問者が選んだベストアンサー
大腸菌で目的タンパク質を発現させたときに、タグをつけて発現させるのが一般的だと思いますので、そのタグに対するビーズを使うと簡単にできると思います。 具体的には、ベクターのみ発現させた大腸菌の抽出液をビーズと反応させた後、そのビーズと抗体をしばらく混ぜた後に、その上清をウエスタンの一次抗体として使えばいいのではないでしょうか？ 目的タンパク質のアフィニティー精製を行うのが一番いいと思いますけど。
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- baba-san
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そうですねえ、たとえば、ベクターのみを入れた 同じ大腸菌のタンパクを何レーンかにわけて電気泳動およびメンブレンにトランスファーしたのちに、そのメンブレンを抗体と反応させ、そののちに抗体を回収し、その抗体を本番のメンブレンと反応させる、というのでどうでしょう？
お礼
アドバイスありがとうございます
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