低分子蛋白量のSDS-PAGEについて

質問

分子量15kDaの蛋白質を15%SDS-PAGEでウェスタンブロティングしています。それまでとてもきれいに出ていてloadingする蛋白量もかえていないのにここ数週間、突然バンドがでなくなったり、でても細く極端にまがったりするようになってとても困っています。Sample buffer(loading buffer)を手作りしており、その影響かもしれないとおもって何度もつくり直すのですが同じ結果です。
何がいけないのでしょうか？

回答No.4

hiroU

SDS-PAGEに問題があるとすれば、他の回答者さんがお答えになった対処法方が適切だとおもいます。
加えて、補足にあったように非特異的なバンドはこれまで同様にしてきれいに見えているのだとしたら、ウェスタンについても対処する必要性があるかもしれません。
１：可能性として、使用している抗体の抗体価が低くなってしまっているかも知れません。何度も使用しているうちに抗体が古くなってしまっているなどの原因が考えられます。この場合、予測される結果の一つとして、特異的バンドは検出されずに、非特異的バンドのみが見られるという状況になり、質問者さんの状況に似ている様に思います。新しい抗体液を使ってみて下さい。
２：転写に注目すると、考えられる可能性は２つあります。１つはゲルが固いので転写されにくくなっていること。故に目的タンパク質がメンブレンへ十分転写されてない可能性です。この場合はゲルを緩くするかSDSを加えると解消されると考えられます。しかし、高分子量がうまく転写されていることを考えると原因としては薄いです。次に、低分子量なので逆に転写され過ぎてメンブレンをタンパク質が通り過ぎてしまった可能性です。この場合は、転写の際の電流を調節してみて下さい。いずれの場合も、転写後のSDS-PAGEゲルをCBB染色してみると原因がつかめます。転写されにくいことが原因の場合はゲルにバンドがハッキリと出ますし、転写され過ぎている場合にはゲルにバンドが無くなっているのに抗体反応ではバンドが検出されないという結果が得られると思います。

以上、ウェスタンに原因があると考えると、現時点では２つが思いつきました。参考になれば幸いです。

お礼

ありがとうございます。新しい抗体液でやってみます。CBBについても確認してみます。