固形（寒天）培地について

質問

現在、酵母用の培地に重金属を添加して、実験を行っています。しかし、ある程度の濃度以上添加すると固まらなくなります。そこで、培地の寒天濃度を上昇させると培地は固まるようになりますか？また寒天濃度をあげることによってどのような害が出るか、知っている方がいたら教えてください。よろしくお願いします。

回答No.1

cholerae · ベストアンサー

どのような目的の実験で，寒天濃度も，添加する重金属の種類も濃度も記載されていないので明確な回答を述べることはできない。しかし，本質問を読んだときに気づいた点を次に列挙する。参考にしてください。
(1)重金属を生育用のトレースエレメントとして添加しているのであれば，寒天が固まらないということ自体おかしい。
(2)寒天濃度は？　通常は1-2%くらいで使用。
(3)寒天濃度を上げれば固まりやすくはなるはず。
(4)一般的に言えば，寒天濃度をあげても生物に対する害はない。しかし，生物の運動性やコロニー中での個体密度には影響するだろうから，２次的な影響は当然でるだろう。
(5)もちろん，寒天に不純物が混入していれば，濃度をあげるとその影響はでるかもしれない。
追伸：この程度の疑問なら実験してみるほうが早く回答が得られると思う。

補足

回答ありがとうございます。
今回の実験の目的は酵母にある遺伝子を導入することにより、酵母に重金属耐性が付与されるかどうか（酵母が生育することができるかどうか）確認をしたいのです。重金属は鉛で、硝酸鉛を使用しています。当然鉛ですので沈殿ができてしまっているのですが、出来れば10mM添加しても固まって欲しいのです。現在のところ3mMの鉛を加えた培地はできていますがそれ以上だと固まりません。僕の読んだ論文では50mMの鉛を添加した培地でも固めることができていて、どうすれば、それぐらい高濃度の鉛を添加した培地でもか固めることが出来るのか、疑問に思い（自分でやってもできなかったため）質問させていただきました。現在の寒天の濃度は2%です。以上補足させていただきました。わかりにくい文章ですがよろしくお願いします。

回答No.5

cholerae

補足説明を読んで重金属耐性に関する実験であることがわかりました。他の回答者が書いていないことで気づいたことを書きます。
(1)酢酸鉛溶液（滅菌済）と滅菌した寒天培地（もちろん酢酸鉛なし）を固化直前で混合し，後は定法に従ってプレートを作製する。これでどうなるでしょうか？もちろん，最終pHは目的のpHになるように事前に調査しておきます。
(2)高濃度の重金属を添加するので，いっしょに適当なキレーターを添加して，より溶解した状態をつくる。
以上

お礼

回答ありがとうございます。

今までは滅菌前に重金属もすべて混合していました。何パターンも実験してみるしかなさそうですね。ありがとうございました。

回答No.4

popomaru

こんにちは。hiroppi1さんがされている実験は「酵母用の培地を作成、PH調節して、その後濾過滅菌で重金属を入れる」という作業でいいですか？もしそうでしたら、最後に重金属塩を入れた時にpHが変わっている可能性はありませんか？もう確認されましたか（よくあります。。）？pHによっては寒天は固まらなくなるので、重金属を入れた時点でpHが通常の培地と一緒になるように設定する必要がありますね。

だからといって最初にまえもって過度にpHを偏らせておく作戦をとろうとすると、反応して培地中に変な塩ができてしまう可能性もありますので注意です。そうなると単純に何も入れていない培地のコントロールとは比較することはできないかもしれません。。。がんばってください。

お礼

回答ありがとうございます。

pHの調整が一番の問題ですね。どのぐらい最初にかたよらせておくかどうかが難しいです。いろいろなパターンをためしてみるしかなさそうですね。

回答No.3

Freeuser

固まらない理由はわかりませんが。
もしかしたら、硝酸鉛の入っていない寒天培地を作って、あとから滅菌した酢酸鉛を塗布しているのかもしれませんね。で、水分を少し飛ばす。
だいたい直径9cmのプレートには25ml程度の培地を固めると思います。それにあわせて、10mMになるように濃度の高い酢酸鉛溶液を100とか200μlくらい塗ればいいんではないでしょうか？あぁ、でもそうすると少し厳密さにかけますかねぇ。
それでもよかったら、硝酸鉛は一応20℃で1.7Mくらいまでは水に溶けるみたいですので、適当に計算してください。

それから、鉛だからといって、純粋な硝酸鉛であれば数mMの濃度で沈殿はしないのではないかと思います。もしかしたら塩化物イオンとか入ってませんか？窒素源の塩化アンモニウムとか。
塩化鉛は沈殿しますので。

お礼

回答ありがとうございます。
その方法で大丈夫ならよいですが、やはり厳密には濃度が違ってくると思います。

酵母の生育する成分が培地中に入っているため、塩化物イオンなどは、入ってしまいます。今まで培地の濃度を低くするなどの対策をしてみても、やはり沈殿してしまってます。

回答No.2

natu77

かなり前に引退した一研究者ですが。

寒天にも固める強さの違うものがあったので、同じ濃度でも寒天の種類によっては、固まらないかもしれませんよ。

文献に使われている寒天の種類を確認されて、同じものを使うとか、または寒天会社にもっと凝固率の高いものを照会されるのも手かと思います。

お礼

回答ありがとうございます。

寒天の種類によって変化するんですね。少し調べてみます。