• 締切済み

プライマー　TEbuffer加える量が分かりません

初心者です。 研究室にあった使われてないプライマーを使ってPCRをかけようと思っています。（乾燥状態-20℃保存） しかし、データシートなどもなく、情報は f : CTTTCACTCCAATCGTCCCTAC Tm 51.0 r : GCTCTCTTTGGAATGCTCAAGT Tm 49.2 のみです。 これより100pmol/μlにするためのTEバッファー添加量をどうやって導きだせばいいのか、分かりません。 初歩的すぎる質問で申し訳ないのですが、どなたか分かる方がいらっしゃいましたら、よろしくお願い致します。

みんなの回答

  • stringf35
  • ベストアンサー率66% (69/104)
回答No.1

残念ながらその情報だけでは必要なバッファー量はわかりません。購入したときのデータシートにnmolなどの記載があるはずです。そのプライマーが未使用なのであれば、同じメーカーから購入したプライマーを溶解するのと同様にやってみて、PCRかからなければ再度購入してはいかがでしょうか。

  1. カテゴリ
  2. 学問・教育
  3. 自然科学
  4. 生物学

関連するQ&A

  • プライマー溶解　希釈濃度

    収量２０nmolの乾燥プライマーをTEで溶解するのですが、最終濃度は10pmol/μlで使います。 この場合、200μlのTEで溶解すると、１００pmol/μl。これを１０本に分注して保存。 １本は20μlで２０００pmol/μl。１８０μlのTEを加えて全体を２００μlにすれば１０倍希釈で、１０pmol/μlになります。 PCRで１ウェルあたりの反応液に使うプライマーは０．４μlです。 分注した１本で500ウェル分？！ こんなに沢山できちゃうものでしょうか？ 大変不安になっています。 私の計算がどこかおかしいのでしょうか？ すみませんが、検証していただけないでしょうか・・。 どうぞよろしくお願いいたします。

  • プライマー希釈

    濃度が100ｐmol/μlのプライマーがあり、それを５ｐmol/μlに希釈してPCRプライマーとして使用してくださいと書かれていました。 そこで、５ｐmol/μl希釈溶液を100μl作成する為には、100ｐmol/μlから５μlとり、水で95μｌ薄めれば濃度が５ｐmol/μlになると考えているんですが、正しいでしょうか？？？

  • PCR　プライマーの希釈

    はじめまして。 生化学系の実験で 初歩的なことで戸惑っています。。。 それはPCRに用いるプタイマーのことなのですが。。。 本当に場かな質問ですが どうぞ教えてください。 1サンプルに付き5pmol/μlもちいりたいのですが 実際のプライマーの原液は100μM/μlあります。 これを希釈し用途思うのですが 皆さんならどのようにされますか？ 一番上手い方法を教えていただけると幸いです。 宜しくお願いいたします。

  • プライマーの希釈について

    これからPCRを行う初心者です。 プライマーを合成してもらい、乾燥状態で届きました。 まずこのプライマーを100μMの濃度にするように言われました。添付文書に27nmolとあったので270μｌの水で溶かせばいいのでしょうか？ PCRには0.2mMで使用したいのですが、100μMにした後、どのように希釈してよいのかわかりません。 計算がわからないので教えてください。 よろしくお願いいたします。

  • PCRのプライマーの濃度について

    PCRについての知識はあまり無く、はじめて、PCRをします。 RAPD法を行ないたいと思い、長さ10merのオリゴマーというものを購入し、これをプライマーとしました。 しかし、内容量　0.5OD、Tm値　32℃としか説明書には　書いてないのですが、 プライマー濃度を1μＭにするには　どうしたらよいのでしょうか？？どのように　計算してよいのか　わからず大変困ってます。どうか、宜しくお願いします。

  • PCRのことについて質問なのですが、現在私が行っている細胞から、DNA

    PCRのことについて質問なのですが、現在私が行っている細胞から、DNAを抽出しPCRを行うという実験で、うまくいかず行き詰っているので質問させていただきます。 現在以下の条件でPCRを行っているのですが、うまくいきません。 組成 forwardプライマー：1μL（=1pmol/μL） reverseプライマー：1μL（=1pmol/μL） Go Taq 5xBuffer：10μL dNTP：5μL(final濃度で200μM) Go Taq DNA polymerase：1μL 鋳型DNA：1μL MgCl2：3μL 滅菌水：28μL 計50μL 反応 ・反応 96℃：5分 ↓ 25サイクル 96℃：1分 55℃：1分 72℃：1分 ↓ 72℃：5分 ↓ 4℃： 設計ではPCR産物の長さは約100塩基ですが、これを行うと50塩基のPCR産物が検出され、100塩基のものはまったく確認することができませんでした。 また、プライマーの長さは約20塩基です。プライマーのTm設定はアニーリング温度を55℃と設定して、それよりも+5℃のTm値を持つよう設計しました。 同様の質問をyahoo知恵袋でも行いまして、回答してくださった皆様の条件でも行いましたが、いずれも同じ結果となってしまいました。 http://detail.chiebukuro.yahoo.co.jp/qa/question_detail/q1449649784 また、最近sigma社のXNATR REDExtract-N-AmpTM Tissue PCR Kitの組成液にプライマーと細胞抽出液を入れてPCRを行いましたが同じ結果でした。 原因、改良点の指摘がありましたら是非教えていだけますでしょうか？

  • 前回の質問の続きで申し訳ないのですが、再びPCRのことで質問です。

    前回の質問の続きで申し訳ないのですが、再びPCRのことで質問です。 http://okwave.jp/qa/q6295149.html 条件を再検討しまず組成を変更しました。 組成 forwardプライマー：3μL（=3pmol/μL） reverseプライマー：3μL（=3pmol/μL） 10xThermoPol Buffer：5μL dNTP：6.25μL(final濃度で250μM) vent DNA polymerase：0.5μL 鋳型DNA：0.5μL formamide:1μL 滅菌水：31.05μL 計50μL 反応 ・反応 96℃：5分 ↓ 25サイクル 96℃：1分 55℃：1分 72℃：1分 ↓ 72℃：5分 ↓ 4℃： 設計ではPCR産物の長さは約100塩基です。また、プライマーの長さは約20塩基です。プライマーのTm設定はアニーリング温度を55℃と設定して、それよりも+5℃のTm値を持つよう設計しました。 また、プライマーは今回2種類使用しています。 結果は添付した画像のとおりスメアとなってしまいました。今現在、dNTPを増やしたり、polymeraseの量を減らしたりということを考えていますが、原因や改良点あればご指摘お願いします。 添付したファイルは 左から通常時2レーン、ホットスタートしたもの2レーン、ホットスタートし40サイクルまわしたもの2レーンとなっています。 一つのDNAから、2種類のプライマーを使い、PCRを行うので、2レーンごとです。 両サイドは100bp Ladderマーカーです。一番下のバンドが100bpです。設計なら、このあたりに出ます。

  • PCR法の成功率up

    卒業研究でPCRを行っています。 しかし、なかなか、思うように増幅できず、悩んでいます。 最近はプライマーダイマーばかり増幅されてしまします。 アニーリング温度やtempreteの量を変更したりと一応工夫はしていますが。。 100サンプルをPCRかけて、ひどいときは全滅という時すらあります。 今ある試薬とプライマーを使って、できる改善方法は何かありますでしょうか!? それとも、新しいプライマーを設計した方がいいのでしょうか!? ちなみに、プライマーのTｍ値　formerd:61.3、reverse:68.1 　　　　　PCR反応液の組成　TaKaRa Ex Taq 0.25μl、Taq buffer 5μl、dNTPとMgCl2 4μl、temperate 3μlにup to 50μl

  • GCリッチなプライマーを使用してのPCR

    PCRで目的物が増えてこなくて困っています。 Oligo Calculatorによる計算では、片方のプライマーが23mer, GC率70%, Tm値64℃で、もう一方は30mer, GC率53%, Tm値64℃です。アニーリング温度を変えたり、サイクル数を増やしたり、template量を変えたり、これより短いプライマーを試した（これより長くしても前者のGC含有量は減らない）のですが、アガロース電気泳動でバンドは検出できませんでした。 原因として考えているのは、 (1)これらの２つのプライマーには、各々のプライマーの中央付近に７bp程度、相補的な部分が存在しているので、プライマーどうしでくっついてしまっている。 (2)前者のプラマーがGC含有量が多いので、プライマー内でGC結合してしまっている。 (3)ポリメラーゼが適切でない（New England Biolabs Vent Polymerase）。 ということです。 (1)の解決策として、相補的な領域が少ない短いプライマーを試したのですが、バンドは検出されませんでした。 この問題の解決法を教えてください。お願いします。

  • PCRがうまくいきません

    ALDH2遺伝子の変異を調べたくPCRを行いましたが上手くいきません。 条件は以下のように行いました。 ネガティブコントロールもサンプルも、すべて同じ20～30bpあたりにバンドがでてしまいます。 コンタミしたのかと思い、すべて試薬、水を新しいものに取り換えて、 ピペットもフィルター付チップに代えましたが同じ結果が出てしまいます。 プライマーは自分で作成したのではなく、ニッポンジーンで紹介されていたものを使用しています。 初心者で、どこを直したら良いのか分からず質問させていただきました。 どなたかアドバイスをください。 2×Ampdirect plus　　　　10.0μl F-primer（50μM）　　　　　0.2μl R-primer（50μM）　　　　　0.2μl DDW　　　　　　　　　　　　　8.5μl Nova Taq（Hot start）　　　0.1μl DNA（ネガコンに水 ） 　　　1.0μl 94℃　2分 - （94℃　30秒 - 60℃　30秒 - 72℃　20秒）30サイクル - 72℃　5分 プライマーは、以下の２パターンです。TEで50pmol/μlに溶解されたものを購入 Ｆ-primer　5'-CAA ATT ACA GGG TCA ACT GCT-3' R-primer 5'-CCA CAC TCA CAG TTT TCT CTT C-3' （正常型） Ｆ-primer　5'-CAA ATT ACA GGG TCA ACT GCT-3' R-primer 5'-CCA CAC TCA CAG TTT TCT CTT T-3' （異常型）

注目のQ&A

カテゴリ

専門家に質問してみよう

職業から探して質問する

あなたにピッタリな商品が見つかる！ OKWAVEセレクト

質問する