- 締切済み
制限酵素のユニット計算について
- みんなの回答 (2)
- 専門家の回答
みんなの回答
- Mr_Spock
- ベストアンサー率75% (57/76)
出題者は、分子数(モル数)あたりで換算する必要があると考えて、同じ1 ugでも、3 kbのDNAは48 kbのDNA(単位定義基質のlambda DNA)より48/3=16倍、分子数(モル数)が多いという計算をしているんでしょう。 しかーし、出題者の考え方は間違っていると思うよ。実践上役に立たない考え方である上に、根本的に間違っていることを教えている疑いが濃厚(名人だか達人だとかおだてられて、どこかのメーカーのお抱えの先生書いている、かなり怪しい手引き書にもそんなことが書いてあったけれど、そんなのを情報源しているとしたら、ダメダメです)。どういう根拠、どういう考え方で計算しているのか、あるいは根拠となる文献はなにか、質問して厳しく追及した方がいいかも。 どういうところが間違っているかというと、 その考えでいくと、おなじ3 kbのプラスミドでもEcoRIが1箇所しかないものと10箇所あるものでは、同じ条件で完全消化しようとするときに必要な酵素は、後者の方が前者の10倍必要ということになりますが、そんなこたあありません。同じ酵素量で切れます。 反応速度論から借りてきて、切断配列のモル数が増えれば、それに比例して酵素量や反応時間が余計にかかるとでも言うのでしょうが、それは違うでしょう。 制限酵素消化が基質も酵素も濃度が中庸なので、反応速度が一次反応の範囲だとすれば、基質濃度が倍になった時に反応速度(例えば一秒で何回切断が起こるか)が倍になるので、完全消化にかかる時間が倍になるわけではないですね。まして、DNAのような巨大分子上にある個々の切断配列の個数を、単純に基質分子の数として考えるのも、それを濃度として考えるのも無理があります。むしろ反応系にあるDNA分子の総延長(これはサイズがちがっても同じ重量のDNAなら一致します)が基質で、基質上を制限酵素は基質上を走査して切断配列に当たったら切る、1 unitは1 ugのDNAを一時間でくまなく走査するのに必要な酵素量(くまなく走査しているので見落とされ切断されなかった認識配列はない、これがすなわち完全消化)というようなイメージの方があたっていると思います。
- Dr_Hyper
- ベストアンサー率41% (2482/6031)
通常の比の式はどうやってたてたのでしょうか? 私が思う簡単な計算方法としては 1ug/48000bp : 1ug /3000 bp = 1 unit : x unit でxを計算して、16になります。 さらにλのほうは5箇所切断するので、pBSに必要なのは、その1/5ですよね。簡単にいうと1ugをbpで割ることでplasmidの数を計算していますよね。
お礼
わかりました!! 丁寧なご説明ありがとうございます。参考にさせていただきます。
関連するQ&A
- 制限酵素
6.5kbpの環状DNAを、遺伝子Wの両端e1とe2を切断する制限酵素E単独で、あるいは制限酵素BまたはHと組み合わせて切断する実験を行った。 6.5kbpの環状DNAにおける制限酵素BとHの切断箇所は不明である。 制限酵素Eで切断すると1.5kbpと5.0kbpの断片が生じた(実験1)。 制限酵素EとBで切断すると1.5kbp、2.0kbp、および3.0kbpの断片が生じた(実験2)。 制限酵素EとHで切断すると0.5kbp、1.0kbp、および5.0kbpの断片が生じた(実験3)。 6.5kbpの環状DNAを制限酵素BとHの2つの酵素で切断すると何kbpのDNA断片が得られると予想されるか。 答:3.0kbpと3.5kbp、あるいは、2.5kbpと4.0kbp。 初めて見るのでどのように解くのか、わからない状態です。
- ベストアンサー
- 生物学
- 制限酵素の仕方
現在、プラスミドが50マイクロリットルの滅菌milliQ水に溶けていて、これを二つの制限酵素で切断しゲル抜きしたいのですが、制限酵素処理の反応系の量がよく分かっていません。 100マイクロリットルの系を作ろうと思っていて、以下のように量を出したのですがこれでいいのかどうか(特にbufferの量)教えてください。よろしくお願いします。 プラスミドが滅菌milliQ水に溶けているもの(TEは入っていない):50マイクロリットル EcoR1とXho1用の10×buffer:10マイクロリットル 制限酵素EcoR1:5マイクロリットル 制限酵素Xho1:5マイクロリットル 滅菌milliQ水:30マイクロリットル 合計:100マイクロリットル
- ベストアンサー
- 生物学
- 制限酵素サイトが目的遺伝子内に存在していた…
EcoR1の制限酵素サイトを含むプライマーと他のの制限酵素サイトを含むプライマーを設計して、目的の遺伝子(約2000bp)をPCRで増幅させました。 しかし、いざEcoR1でのファストダイジェストをしアガロース電気泳動をすると、目的の位置ではなく約1000bpのところにバンドが現れました。 遺伝子のデータベースで確認したところ、目的遺伝子の配列中にEcoR1サイトと全く同じ塩基配列があることに気付きました。 泳動結果と照合して、おそらくその位置でEcoR1により切断されたのだと思われます。 私の不確認が原因だとわかっていて、すごく後悔しています。 この場合、EcoR1のサイトを含まないプライマーを設計しなおすのが妥当であると考えられますが、 もしも、なんとかこのEcoR1の制限酵素サイトを含むプライマーを用いてPCRをした断片を目的の位置で制限酵素処理できる方法がもしもありましたら、教えていただけませんか。 どなたか打開策をご存じな方がいらっしゃいましたら、わかりやすく教えてください。 また、このことを相談したところ「EcoR1(NEB社)がAのオーバーハングしているか、Aの付加反応があるか」を調べてみることになりました。 この件を調べることで、何か改善できる点があるのか、自分なりに調べましたが答えが見つかりません。 恥ずかしながら知識不足のゆえ、わかりやすく解説していただけ方がいらっしゃると幸いです。 また、その調べ方だけでもご存知の方がいらっしゃいましたら、自分の勉強のためになりますので調べ方(本等でもかまいません)を紹介していただけませんか? 長文になりましたが、ぜひともよろしくお願いいたします。
- 締切済み
- 生物学
- λDNAの制限酵素による切断
λDNA(4.8kbp)をSalI、EcoRIで切断したのですが、バンドが一本しか検出されませんでした。移動度からこのバンドは約5200bpとでたのですが、5200bpのDNA断片が約9本できた、と考えてよいのでしょうか?また制限酵素の認識部位の位置関係を知りたいのですが・・。 回答よろしくおねがいします。
- ベストアンサー
- 生物学
- ゲル電の際、制限酵素でDNAを切る意味
大腸菌からDNAを生成した後、DNAを制限酵素で切ってゲル電を流すことで生成できたか確認しますが、切断するとなぜ統一された長さになり、切断しないとなぜさまざまな長さのバンドがでてくるのでしょうか。例えば、3000bpのDNAを生成したとすると、切断せずにそのままゲル電を流したら3000bp以下のところにいくつかバンドがでてきて、切断すると3000bpのみのところにしかバンドがでてこないのがなぜなのかがわかりません。
- ベストアンサー
- 生物学
- 制限酵素 BamHIについて
最近生化学の実験で制限酵素BamHIを用いて、その性質や働きを電気泳動で調べました。 制限酵素により切られたバンドを確認してみると、一つは1353bp付近に、もう一つは310bp付近に見ることができました。一応実験的には成功なんだと思いますが、後日生化学辞典で調べてみるとBamHIのような6塩基配列を認識するクラスII酵素は、DNAを平均約4000塩基対毎に切断すると書いてありました。 これは実験結果とはだいぶかけ離れているのですが、BamHIが例外的にこのような性質を示すのでしょうか? 宜しくお願いしますm(__)m
- 締切済み
- 化学
- プラスミドの制限酵素処理
プラスミドを作る時、制限酵素で切断しますよね。切断したサンプルは電気泳動をして、目的のサイズの部分のゲルを切り出して精製して、ライゲーションするわけですが、セルフクローニングがたくさん出てしまい、なかなかうまくいきません。 2種類の酵素で処理(切断部位が近接(数~数十bp))していて、脱リン酸化処理はしていません。2カ所で切断されていれば、脱リン酸化にかかわらず、セルフライゲーションは起こらないはずだと思うので。 だとすると、どちらか一方の酵素でしか切断されていないものが多いことが原因だと思います。1カ所切断と2カ所切断のサイズが同じぐらいであるため、分離するのは難しいと思うのですが、何かよい方法、アドバイスはありませんでしょうか?
- ベストアンサー
- 生物学
お礼
なるほど~分子量で考えてるわけですね。 そう考えると納得ですね!! 詳しい回答をしてくださってありがとうございます。 参考にさせていただきます。