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EDTAによる抗体賦活化を行うと切片がはがれてしまうのですが…
現在、免疫染色を行っています。 私はパラフィン切片を用いているのですが、EDTAによる抗体賦活化を行うと切片がはがれてしまいます。 クエン酸バッファーではシグナルが出ず、EDTAの方が自分の染めたいものに関しては感度がいいようなのでどうしてもEDTAで行いたいのですが。。 方法は、薄切後、37℃インキュベーターでover nightしたパラフィン切片を脱パラ、流水水洗後、1mM EDTA中に入れ、オートクレーブで１２０℃１５分加熱処理しています。 スライドガラスはＭＡＳコートを用いています。 どこか悪いところがあるのでしょうか？
- noriman
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質問者が選んだベストアンサー
抗原賦活化ですよね。抗体賦活化ではなく。 色々原因は考えられますけど、多分、スライドグラスへの切片の接着が 足らないんじゃないでしょうかね。 ３７度→５０度でオーバーナイト、で、何とかなるんじゃあないでしょうか。
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- kudann2001
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今まで37℃でインキュベートしてきた切片をもう一度60℃でインキュベートしても効果はないんでしょうか？ ↑ 大丈夫です。要するに、切片をベターッと、ガッチリと、ガラスにくっつけるのが目的です。ただ温度ですが、５０度位が良いと思います。 ６０度はパラフィンの融点なので、切片も一緒に溶けて、形が変わっちゃいますよ。 pH８の強アルカリEDTA処理は、蛋白を強力に溶かすので、ガッチリ接着させる必要があるということです。
お礼
解決しました！助かりました。ありがとうございました。
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お礼
ありがとうございます。 薄切後のインキュベート温度は関係ありそうですね。 試してみようと思うのですが、今まで37℃でインキュベートしてきた切片をもう一度60℃でインキュベートしても効果はないんでしょうか？ あと、参考URLも非常に参考になりました。ありがとうございます。