HPLCの蛍光検出器

質問

HPLCの蛍光検出器で蛍光を出さない多くの物質について蛍光誘導体を作ることができるそうですが、これはどのような操作をすればいいのでしょうか？またHPLCで蛍光検出器を使用することについての長所と短所を教えてください。

回答No.1

chicago911 · ベストアンサー

＞HPLC の蛍光検出器で蛍光を出さない多くの物質について蛍光誘導体を作ることができるそうです
この文章意味不明なんですが。と言うのは、後段の

＞HPLC で蛍光検出器を使用することについての長所と短所
から答えて方がわかりやすいので、こちらから行きます。

蛍光検出器、とは文字通り、蛍光を検出するものです。何の処理をしなくても蛍光を発する物質もないことはないですが、ある特定の化学構造があると、一定の波長の光を当てると、蛍光 (別の波長の光) を出す現象は、よく知られています。これを応用したものが、蛍光検出器で、HPLC からの Eluent を Flow Cell に連続的に流し、ここへ励起光を照射、生じる蛍光を測定します。蛍光の測定原理は、一般的な UV と同様です (尤も UV は吸収なので、ある意味逆ですが、強度の測定、と言う意味では一緒です)。そこで、UV では、非特異的吸収の測定になるため、Interference の存在を排除するための、前処理、HPLC Condition の設定が、非常に難しいことがありますが、蛍光の場合は、特異的に蛍光を出すことになるので、Interference の影響がかなり緩和されます。また、強度の関係で、測定感度が上がる、という Merit もあります。

一方、物質自体が蛍光を発することが少ないので、蛍光物質と言う特定の化学構造を持つ物質 (誘導化物質) を付加する必要があり、この作業を誘導体化、出来上がった物質を誘導体と言います。この処理は、HPLC で分析する以前に行ない、過剰量加えて誘導化物質、誘導体化する条件を設定するために加えた物質等をある程度は除去する必要もあり、この前処理が、複雑すること、どうしても HPLC にかける状態の Sample 中の Interference が、多の分析法に比べ多くなるために、Column の劣化を早める傾向がある、などの短所があります。

また、適切な誘導体化の条件を設定するにも、かなりの時間を要することもあります。

ちょっと特殊な例ですが、強アルカリ条件下では蛍光を発する物質の測定を行なったときは、HPLC 本体、Cloumn には強アルカリは流せませんから、Post Column で強アルカリを加え、蛍光検出器に誘導したこともありますが、測定終了後直ちに Line　を洗浄する要があり、そのために System を構築したこともあります。

ということで、冒頭へ戻りますが、蛍光検出器で蛍光誘導体を作ることはできません。多くの物質かどうかは知りませんが、蛍光標識を付加できる物質、例えば －NH2 に対する OPA などは、成書に多数掲載されていますから、この位のことは、御自分でお調べください。Text 形式のここに書き出すのも大変ですから。そこには、誘導体化の一般的方法も併記されている筈です。

お礼

大変役に立ちました。ありがとうございました。