HPLCでの有機酸測定について

質問

生体サンプル（盲腸および糞中）の有機酸の測定（特に乳酸およびコハク酸）をしたいと思っています。
図書館で調べたり、抽出方法などを考えて測定しているのですが、残念ながら知識がほとんどなかったりするので、測定結果も芳しくありません。

pubmedなどは探したのですが、イオン交換クロマトグラフィーでほとんど測定されています。
私は逆相クロマトグラフィーで東ソーのODS100というカラムを用いて測定しようと思っているのですが、なかなかうまくいきません。

測定条件・サンプル処理法についてアドバイスや参考となる文献を教えて頂きたいと思います。なお、下記に現在の測定条件を書いておきます。知識のなさ故に、全く見当違いの方法でやっているかと思います。
優しく突っ込んで頂けると助かります（>_<）

現在の測定条件：移動相-0.1 %リン酸 , 検出波長-210nM

サンプル処理法：
１　サンプルを純水にて抽出して遠心分離
２　上清に1N過塩素酸 200μL入れて蓋をして加熱し、タンパク除去
３　ふたを外して加熱し、揮発性物質の蒸発させ、遠心分離
４　上清にクロロホルムを入れて脱脂質し、遠心分離し、クロロホルムを除去
５　上清ヘキサンを入れ、さらに脱脂質し遠心分離
６-1　上清をHPLCに注入（感度が低いながら、分析可能）

感度を上げるため、濃縮乾固を行いたいので、実際は
6-2　上清に0.2N NaOH/MeOH 1mLで塩化して濃縮乾固
７　純水で溶解してHPLCで注入（これだと、うまく分離できずピークが検出できない）

というやり方です。
細かい事でも良いので、突っ込みor参考図書・文献があれば、宜しくお願いします。

回答No.1

elpkc

波長がかなり低いですね。

まず、同様の方法で行ったものを対照として、
サンプルの吸光スペクトルを測定していますよね。

内標を入れていないようなので。その極大吸収の波長に合わせていますよね。

それと、乳酸と、コハク酸の標準を同じ抽出方法で行った検体は測定していますよね。

いかがですか?

お礼

波長ですが、カルボキシル基をターゲットとしているので、この波長にしています。いくつぐらいが適当でしょうか？

また内部標準関して書いてないですが、アクリル酸を用いており、吸光スペクトルも測定しています。
・この210nm付近で非常に大きく吸光している事
・内部標準をいれていない乳酸およびコハク酸のみでも大きく吸光をしめすこと
・カラムの計測データから

という理由でこの波長を選択しています。

同じ抽出方法も用いてやっています。
・生体サンプル
・生体サンプル＋濃度勾配をつけたサンプル
・濃度勾配のみのサンプル

と、数点を同時に処理を行い、３連で測定しています。