膜タンパクのトラフィッキングについて

質問

ロドプシンを中心にトランスフェクションをしているのですが、今のところ、MEFとCOSでトランスフェクションしたところ、うまい具合に細胞膜へトラフィッキングされません（免染した際に細胞質・とくにERのあたりが光り、細胞膜はクリアー）。

ロドプシン関係のトランスフェクションはほとんどのペーパーにおいてHEK（極性をもつ）で行われているのですが、現在の研究内容の都合上、どうしてもCOSかMEFで事を進めたく思っています。

やはり、細胞種によってトラフィッキングに問題が生じたりするものなのでしょうか。何かアドバイスございましたらよろしくお願いします。

回答No.2

Chicago243 · ベストアンサー

もし可能なら１度ウエスタンでサイズを確認されてはどうでしょうか、糖鎖修飾が変わってしまって分布が変わっているかもしれません。サイズで解決するか分かりませんが、サイズが他の細胞から得られるものと違えば、その可能性がかなり高いと思います。

お礼

返事が遅くなって申し訳ありません。
ウエスタンで確認したところ、非常に弱いシグナルが検出できました。ポジコンと比べてあまりにも弱すぎるので、細胞の回収をもう少し後にしようかと考えています。

回答No.1

Chicago243

overexpressionトラフィッキングシステムが飽和してしまう場合とトラフィッキングに関係する糖鎖修飾、認識酵素などの発現バターンが違うためトラフィッキングパターンが違うことがあります。
前者の場合は発現を低くしてみるのは手かもしれません。SV40oriのないプラスミドや発現が誘導できるものを使ってみるといいかもしれません。
あと、ERなどのシグナルが強すぎて膜での発現を見落としてませんか?

お礼

お返事ありがとうございます。
プラスミドの濃度を下げ、２次抗体の希釈もいろいろふって検討してみたところ、膜での発現が確認できました。
ですが、ゴルジやERでの発現具合が強すぎるようです。
きれいに膜だけに移行させるにはどうしたらよいものか、依然困っています・・・