- ベストアンサー
定量法が・・・
noname#17364の回答
こんばんわ。 標的にする蛋白と、使う抗体によりけりです。ホルマリンでOKのものもあれば、だめなものもあります。凍結切片が良いものや、特殊なコンパウンドで保存するやり方もあります。 市販の抗体をご利用であれば添付のマニュアルに注意事項が記載されているでしょう。それに従ってやればいいとおもいます。そうでなければ、参考にしている文献を良く読んで、同じようにやればできるんじゃないでしょうか？ ちょっと一般的な回答ですが、ご参考になればいいのですが。
- noname#17364
関連するQ&A
- 免疫染色の原理について
免疫染色の原理について 仕事で、免疫染色をすることになりました。 文献で調べてみたところ、プロトコルは手に入りましたが、いくつか原理が分からないところがありました。 ・ブロッキングについて 1次抗体を反応させる前に、他種の血清を切片にかけて、標的タンパク以外のタンパクをブロックして、非特異反応を防ぐ、とのことですが、そもそもなぜ他種の血清をかけるとブロッキングになるのでしょうか？ 抗体の非特異反応とは、標的タンパクのエピトープに似た分子構造を持つタンパクが他にあればそこに抗体が結合してしまう反応と解釈しているのですが、他種血清をかけることで標的以外のタンパクがブロックされるという原理が分からないです。 例えばヒトの口内粘膜上のTLRを抗ヒトTLRマウスモノクローナルIgGを1次抗体として染めるとして、この試料を、例えばカエル血清で処理するとなぜ、非特異反応を防げるのでしょうか？ カエル血清に、ヒトTLRと1次抗体の結合だけを保護し、TLRに類似するエピトープを持つタンパクと抗体の反応を抑制するなどというピンポイントな機能があるとは思えないないです。 実際にはTLR以外を染める場合でもカエル血清は有効とのことですし（カエルでなくてもヒトと類似するタンパクを持っていない生物の血清であればいいそうですが）。 ・試料を過酸化水素水で処理する理由 DAB法ではDABと過酸化水素とHRPで標識した2次抗体を発色しますが、この反応の非特異的な発色を防ぐために、試料中のもともとあったペルオキシダーゼを失活するために過剰な過酸化水素水で試料を処理するとありました。 ペルオキシダーゼはミトコンドリアの水素伝達系で生じた過酸化水素やフリーラジカルを分解する酵素とのことですが、過酸化水素を分解する酵素が、過酸化水素で失活するものなのでしょうか？過剰であれば壊れるのでしょうか？ 酵素は反応を促進させるものであって酵素自体は反応の際に構造は変化しないと記憶しているのですが。 また、過酸化水素は有機系の高分子を破壊するものと思っていましたが、標的タンパクを変性させる可能性はないのでしょうか？ 知識がないもので、的外れなことや間違ったことを書いているかもしれませんが、よろしくお願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
- 免疫染色を分泌蛋白で検出できますか？
免疫染色を用いて、炎症組織で分泌する細胞が浸潤してきたことを調べたいと思い、いろいろと試していますが、うまく染色することができません。 見たいタンパク質はサイトカインです。LPSを投与して刺激した後に、各種のサイトカインの発現パターンを免疫染色で調べています。 １）分泌蛋白を染色する場合には組織の固定方法をパラホルムアルデヒド で行うことで問題は無いでしょうか？ ２）固定は還流固定の方がいいのでしょうか？ ３）分泌されている蛋白が大量にある場合には、特定の細胞を染め出すということはできないのでしょうか？ ４）染色できるとしたらどのようなサイトカインであり、染色できないのはどのようなサイトカインでしょうか？ ５）使用する抗体によって結果が大きく左右されるものなのでしょうか？ 以上よろしくお願いいたします。
- ベストアンサー
- 生物学
- ウエスタンブロットは上手くいかないが免疫染色可能な場合
実験経験の浅い者です。初めて質問します。 細胞質、細胞膜上で発現しているあるタンパクに対する抗体を作成中です。既報にならって、合成ペプチドから抗体(血清)を作成しました。 目的の抗体ができているかを確かめるために、ELISA、ウエスタンブロット、免疫染色をしたのですが、ELSA、免疫染色は問題なく、ウエスタンブロットだけうまくバンドがでませんでした(非特異的なバンドのみ)。 発現しているはずの細胞を抗原としてβ-メルカプトエタノール、SDS入りのサンプルバッファーで溶解処理して、通常のSDS-PAGE、1次抗体は血清、2次抗体はWB用の抗体を使用しました。 免疫染色では、血清を2000倍希釈しても十分染色できました。 高次構造が変わると抗原性がなくなってしまうということなのでしょうか。 だとすると、ウエスタンブロットでは、還元剤なしにするとよいのでしょうか？何かよい方法はありますでしょうか。 よろしくお願い致します。
- ベストアンサー
- 生物学
- 免疫染色のブロッキングで、2次抗体が作られた動物の正常血清を用いる理由？
免疫染色のブロッキングで、2次抗体が作られた動物の正常血清を10%処理するようにプロトコルに書いてあります。何故"2次抗体"が作られた動物の正常血清を用いるのでしょうか？また、"2次抗体が作られた動物の正常血清"を用いると抗体の非特異的結合が減少する原理はどうなっているんでしょうか？
- ベストアンサー
- 生物学
- 細胞骨格タンパク質の免疫染色について。
細胞骨格タンパク質の免疫染色についてお伺いします． ある細胞骨格蛋白（中間径フィラメント）の抗体を用いて免疫染色された正常組織の写真があるサイトに載っていました。その抗体の説明書には『局在；細胞質』と書いてあるにもかかわらずその写真では核にのみ染色性を呈しておりました．ちなみにそのサイトには同じ標本を別の会社の抗体でも染めているのですが、そちらの抗体を使用した写真では完全に細胞質のみが染色されております． そこで、細胞骨格蛋白（中間径フィラメント）の場合にのみ限定してお聞きしたいのですけれど、 1.このようなことが起こる原因としてどんな事が考えられますか？. 2.ご自分で実験された場合そのような結果が出た時はどう解釈しますか？ 何卒よろしくお願いいたします．
- 締切済み
- 生物学
- 海馬初代培養の蛍光免疫染色 ～固定法について～
日頃お世話になっております。 海馬初代培養の蛍光免疫染色法での固定法について教えてください。 培養神経細胞のシナプス蛋白質(vGluT1,PSD-95など)を染色する目的で、 蛍光免疫染色を行っております。 その際、4% PFA (Pre-warmed at 37℃)にて細胞を固定しているのですが、 いくつか論文を調べてみると、4%PFA / 4%スクロース で固定を行っている方も多いようです。 固定の際に4%スクロースを入れる目的とは何でしょうか？ また、シナプス蛋白質を染色する目的の場合は、 4%スクロースを入れて固定した方が良いのでしょうか？ 入れても入れなくてもあまり違わないのでしょうか？ ご存じの方がいらっしゃいましたら、ご指導・ご鞭撻のほどよろしくお願い致します。
- ベストアンサー
- 生物学
- 免疫組織染色とDAPI について
現在、核に局在すると推定しているタンパク質について免疫組織染色解析を行なっています。そこで、あわよくば細胞内局在まで見てやろうと思い、発色後の組織をDAPIで染色して観察しているのですが、どうも免疫染色のシグナルが強い切片ほどDAPIの蛍光が弱いのです。（DAPIは、ネガコンのpreabsorbedで最も良く染まり、次に抗体希釈条件によって免疫染色シグナルが弱いものが染まりやすいです。強く発色させたものでは、前二者で染まっていた細胞でも全くDAPI蛍光が観察できなかったりします。） そこで、質問なのですが、核にあるタンパク質に結合した一次・二次抗体および標識タンパク質や発色物質によってDAPIの浸透が阻害されるようなことはありえるのでしょうか？ 必要そうな諸条件を以下に書きます。 ・ブロッキング：10%(w/v) BlockAce, 10%(v/v)ヤギ正常血清 in PBS ・一次抗体希釈液：0.3% PBS-BSAまたはCan get signal solutionA(TOYOBO) ・二次抗体：ビオチン化抗ウサギIgGヤギ抗体 ・ABCキット：VECTASTAIN Elite ・発色試薬：DAB（Niは使用しない） ・DAPI染色：1 ug/mlで5 min（遮光） ・封入：余分なDAPI溶液を軽く除いてから、水溶性封入剤VectaMount AQ (VECTOR)、 ・遮光して乾燥後観察
- ベストアンサー
- 生物学
- 免疫蛍光法における染色について
実験を始めて間もないのですが、ご教授いただければ幸いです。 受容体の細胞外ドメインのsheddingを免疫蛍光法にて証明したいと考えています。 ある受容体の細胞外ドメインを１次抗体とし、goatの2次抗体で染めたいのですが、細胞内も染まってしまいます。この場合、細胞を生かしたままで１次抗体をover nightした方がいいのか、それともパラホルムアルデヒドで固定してからの方がいいのでしょうか？ また、細胞を生かしたまま染色を行う方法を教えていただければ幸いです。
- 締切済み
- 生物学
- 免疫組織化学について
初歩的な質問ですが、おねがいします。 免疫組織化学を行うことになったのですが、抗体について質問させてください。 マウスの切片をＡＢＣ法により染色しようと思うのですが、一次抗体にマウスで作成した抗体を用いることはできるでしょうか？ 二次抗体で抗マウスＩｇＧ抗体を使用した場合、内在性のマウスＩｇＧを認識してノンスペが出そうですが、当研究室には目的のタンパクを見る抗体がマウスで作成したものしかなく、値段的に新しい別の抗体を買うのは厳しいようなのです。 二次抗体のみを使用したネガコンと比べて比較等可能でしょうか。 よろしくお願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
お礼
ありがとうございます。このタンパクはisoformがたくさんあるので参考文献も完全にヒットしているわけではありませんが、参考文献にはホルマリンに・・・とあります。標的タンパクはglucose transporterで、ウエスタンブロットでは検出できるのですが、ホルマリン漬けの臓器をスライスしてプレパラートを作って抗体を結合させようとするとくっつきません(というか検出できません）。ちなみに臓器は腎臓です。凍結切片も試してみましたがこれもだめでした。となると考えられる原因は？？？