- ベストアンサー
TCA沈殿の溶解
- みんなの回答 （2）
- 専門家の回答
質問者が選んだベストアンサー
中和だけでもかなり違うでしょう。また許容量以下のサンプルバッファーを加えるとなかなか溶けません。 イエローチップの先で固まりを壊すといいでしょう。 ソニケーターで高分子量のDNAは壊れるが、一般には蛋白は壊れないとされています。これはBSAなどで（もしくはウエスタンでも）実験してみれば一目りょうぜんです。
その他の回答 (1)
- ga111
- ベストアンサー率26% (247/916)
BPBの液が黄色くなるなら、1M Tris pH7.5など緩衝力のあるものを適当にいれてまず中和します。 そのあと棒状タイプ（なければバスタイプ）のソニケーターで攪拌するとかなり溶けます。それでも残るものは遠心して除いて諦めましょう。
関連するQ&A
- 沈殿後のタンパクの溶かし方
藍藻類からタンパク質を抽出し、二次元電気泳動にかけようとしています。 タンパクの抽出後、精製のためアセトン＋TCAで沈殿させているのですが、この沈殿が非常に溶けにくく困っています。どなたかよい方法をご存じであればアドバイスください。 よろしくお願いします。
- 締切済み
- 生物学
- SDS-PAGEの染色について
クマシー染色で、バンドが全く染色されません。マーカーだけがいつもあるだけで後は透明です。何が原因なのでしょうか？サンプルとしては、液体培養で育てたカビの体外分泌タンパクで、上清をTCA沈殿やアセトン沈殿で40倍ぐらいに濃縮して使ってます。
- ベストアンサー
- 生物学
- タンパク質のｐＨ沈殿
卵白からリゾチームを精製する実験をしています。 卵白に含まれるリゾチーム以外のタンパク質を除去するために卵白希釈液のｐＨを7.5に調整しました。 その後濾過して開始バッファと平衡化して～と色々実験が続いていくのですが・・・。 ｐＨ沈殿の目的に、目的タンパク質の濃縮も兼ねる、とテキストに書いてありました。 その他タンパク質を沈殿させて除去するためにやっているのに、なぜ濃縮までされるんでしょうか？？
- 締切済み
- 化学
- 電気泳動 CBB染色 脱色液方法について
理系大学生です 電気泳動のCBB染色後の脱色液のことで二つ質問があります 脱色液の組成について、一般的にはエタノール(またはメタノール)約25%、酢酸約7.5%を用いられますが、5%程のTCA溶液を代わりに用いてはいけないでしょうか と言いますのも、低分子のタンパク質の染色が悪いのでこのように脱色液の組成を変更したところ染色できるように成りました。しかし、染色結果を定量的に評価する際に問題ないのかが分かりません 二つ目は、有機溶媒を溶かした脱色液である程度脱色を行った後は、蒸留水を用いて脱色をしてはいけないのでしょうか よろしくお願い致します
- ベストアンサー
- 生物学
- アセトン沈澱のいろいろ
ＣＳＦ（脳脊髄液）をアセトン沈澱させようと調べると (1)サンプル＋サンプルの100倍量のアセトンを ON ICEで30分、その後遠心30分（4℃12000rpm） (2)サンプル＋サンプル3倍量の冷アセトンを -20℃で2時間インキュベート後、遠心5分（1000rpm) など方法がいろいろで、どれが最適かわかりません。 予想するに、遠心を長時間使えない状態だったり 電気代を考えると(2)が良いのでしょうか。 A :目的タンパクによると思いますが いったい何がどう最適かは、そのタンパクによるんでしょうか？ B:それぞれの条件をかえてどれが回収率が最適か 自分で検討するしかないのでしょうか？ C:アセトンを加える量にこんなに差があっていいんでしょうか？ （１：１００と１：３というのは・・・）
- ベストアンサー
- 生物学
- TCAの除去
以前にも同様の質問をさせて頂きましたが、その時はジエチルエーテルの除去について伺いました。 http://oshiete1.goo.ne.jp/qa2299349.html これについては解決しましたが、現在は抽出液中に残留したトリクロロ酢酸（TCA）が酵素反応を阻害している可能性を疑っています。 上記質問内容のコピペですが、以下に実験操作を説明します。 植物組織から解糖系の中間代謝物である糖リン酸を抽出して酵素法で定量 組織を磨砕し、16% (w/v)トリクロロ酢酸（TCA）を含むジエチルエーテルで抽出します。その抽出液に16% (w/v)TCA水溶液を加え、遠心機にかけてからジエチルエーテル相を取り除きます。水相に残留しているTCAを除去するために再びジエチルエーテルを加えて二相に分離させてから取り除くという操作を数回繰り返します。こうして得られた水相を糖リン酸の試料液として酵素法による定量に用います。 抽出液に既知量の標準物質を加えても酵素反応が正常に進行しません。標準物質のみの場合は正常に進行するので、酵素を含めた試薬には問題がないことは確認されています。 －気になる点－ 水酸化カリウムまたはトリエタノールアミンを添加して抽出液の中和を行っていますが、その際、もやもやした赤色の物質が生成してしまします（遠心すると沈殿します）。この赤色の物質はスルホサリチル酸水溶液で抽出する別の分析でも観察されますが、いったい何でしょうか？ 質問はタイトルどおりですが、抽出液からTCAを取り除くためにはどうしたらよいでしょうか？また、酵素反応を阻害しないようにする方法が別にあれば、教えてください。論文をみるかぎりでは、ジエチルエーテルを使う以外の方法はみつけられませんでした。 よろしくお願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
- タンパク質は熱変性でpHも変わってしまうのですか？
SDS-PAGEの際に、サンプルをボイルしますよね。タンパク質は熱変性を起こしていると思うのですが、ボイルする前と、タンパク質のpHは変わってしまっているのでしょうか？ また、変わるとしたら、アセトン沈殿させるなどしたら、立体構造のようにpHも元に戻すことはできるのですか？
- 締切済み
- 哲学・倫理・宗教学
- タンパク質定量とSDS-PAGE
現在あるタンパク質を精製しています。このタンパク質の同じ希釈のサンプルを使用しても、Lowry法では一定濃度を示し、Bradford法ではまったく発色しません。なのでタンパク質定量はLowry法で行っています。そしてSDS-PAGEをCBB R-250で染色しようとしてもまったく、染色できません。銀染色で行うとぼんやりとバンドが出る程度なのです。これはただ単にタンパク質濃度が低いだけなのでしょうか？それとも何かいい方法があるのでしょうか？教えてください。また何かアドバイスがあったらいただきたいです。
- 締切済み
- 生物学
- ウェスタンで転写されないタンパク
活性染色ではポジティブの培養上清中のタンパクがウェスタンでは検出されなかったため、転写後のゲルをCBB染色してみたところ、目的タンパクサイズ付近のみ、くっきりゲル上にバンドが残っていました。気泡などの問題ではなく、何度やってもバンドとしてくっきり残っています。目的タンパクのｐIは６くらいで、使用している転写バッファーはｐH8.6くらいです。ｐHに問題はないように思えるのですが。。。セミドライよりウェットの方が良いのでしょうか。また、In Gelで行うものも最近ありますが。どなたか同じような経験された方いらっしゃいますか。
- 締切済み
- 生物学
- Lowry法でタンパクを定量するとき、コンデンスミルク状の沈殿ができて困っています
培養細胞を２*ＴＮＥバッファーで溶解し、あるタンパク質をウエスタンで検出しようとしています。１レーンあたりのアプライ量を等しくしたいので、ローリー法で定量しようとしていますが、コンデンスミルクのような沈殿ができてしまいます（できないときもありますので、このへんがよくわからないんですが・・・）。 定量するときには、タンパクサンプルをmilliQ水で１/２０に希釈してから行っているので、界面活性剤やその他の沈殿しやすそうなものの濃度はかなり薄まっているとは思うのですが、コンデンスミルク状のものができるときがあります。 このままＯＤを測定しても、ちゃんとした値になるはずもないし、ちょっと困っています。自作の試薬で行っています。フェノール試薬のみ、出来合いの製品を購入しました。 この件について、解決策を知っているかたいらっしゃいましたら、教えてください。定量できればなんでもいいです。ローリー法にこだわりはなく、１レーンにアプライする量を調節できればそれでいいんですが。よろしくお願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
補足
ソニーケーションはできるだけ避けたいです。 というのも、 TCA沈殿で、沈殿を一応溶かした液でタンパク定量を行うと すべてのタンパクを回収できていない （回収率30％くらい） という結果があるので、この原因は 『TCA沈殿で、タンパクをちゃんと沈殿できていない』 『TCA沈殿で、沈殿を溶かしきれていない』 の2つにしぼりたいんで… 個人的に、 ソニーケーションをすれば、タンパクも切断されて 抗体との反応性が変わると思うんですが