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ウェスタンで転写されないタンパク
活性染色ではポジティブの培養上清中のタンパクがウェスタンでは検出されなかったため、転写後のゲルをCBB染色してみたところ、目的タンパクサイズ付近のみ、くっきりゲル上にバンドが残っていました。気泡などの問題ではなく、何度やってもバンドとしてくっきり残っています。目的タンパクのｐIは６くらいで、使用している転写バッファーはｐH8.6くらいです。ｐHに問題はないように思えるのですが。。。セミドライよりウェットの方が良いのでしょうか。また、In Gelで行うものも最近ありますが。どなたか同じような経験された方いらっしゃいますか。
- frankfurterapfel
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- Dr_Hyper
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泳動の条件 （nativeなのかSDS-PAGEなのか） transfer bufferの組成 SDSが入っているのか、MeOH濃度は などによって申し上げることも変わってきそうです。 SDS-PAGEでこのようなことが起こるとすると相当なくせ者ですね。ただ泳動されるのにウエスタンでも検出されない程度にもtransferされないというのはおかしい感じもします。試しに上清をそのままニトロセルロースメンブレンにスポットしてdot blotを行ってみたらどうでしょうか？ 抗体などの検定になるだけでなく、コントロールさえしっかりしていれば、バンドを確認できなくとも存在ぐらいは証明できますね。
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