- ベストアンサー
電気泳動 CBB染色 脱色液方法について
理系大学生です 電気泳動のCBB染色後の脱色液のことで二つ質問があります 脱色液の組成について、一般的にはエタノール(またはメタノール)約25%、酢酸約7.5%を用いられますが、5%程のTCA溶液を代わりに用いてはいけないでしょうか と言いますのも、低分子のタンパク質の染色が悪いのでこのように脱色液の組成を変更したところ染色できるように成りました。しかし、染色結果を定量的に評価する際に問題ないのかが分かりません 二つ目は、有機溶媒を溶かした脱色液である程度脱色を行った後は、蒸留水を用いて脱色をしてはいけないのでしょうか よろしくお願い致します
- z0index
- お礼率93% (14/15)
- 生物学
- 回答数3
- ありがとう数9
- みんなの回答 （3）
- 専門家の回答
質問者が選んだベストアンサー
No.2です。 定量精度低下には繋がらないでしょう。 5%TCAで精度が疑われるのなら、通常の脱色液（エタノール＋酢酸）でも然りです。 もちろん、染始めや完全に脱色してしまった後は精度云々の話ではなくなります。 脱色は、タンパク質がない部分のバックを減らすのが目的ですので、バックが無視できる濃さ （バンドがキレイ確認できる濃さ）になれば、定量することができるでしょう。 CBBのバンドを定量するのは、主に目玉ですが、バンドの濃さと太さを定量してくれるソフトもありますね。 データを客観視するなら、このようなソフトを使うのが良いと思います。 CBBやウェスタンのバンドを定量化してグラフを描いたりしている論文もありますが、バンドを囲う時にバイアスも多少かかるでしょうから、あくまでCBBでの定量は、「バンドの定量値」としてお考えになるのが良いと思います。 バンドが複数で目的のタンパク質にタグが付いているならタグによる精製、分子量が違うならゲル濾過後に定量、トータルタンパク量で良いならUVやBCA基質でのタンパク質定量もできます。 CBBでの定量だけに拘らず、他の方法でも目的のタンパク質を定量できるのであれば、定量することをお勧めします。 その方が人を説得させられるし、先入観のない正しいデータを出すことができます。 ではでは、頑張ってください。
その他の回答 (2)
- browntraut
- ベストアンサー率72% (72/99)
２種のご質問に対し、いっぺんにお答えします。 まず、脱色したい溶液にCBBが溶解可能かどうかを調べる必要があります。 容易に溶けるのであれば、その溶液を脱色液にすることは可能でしょう。 つまり、5%程のTCA溶液にCBBがグングン溶けるのではれば、可能ということになります。 たしか、CBBは水にあまり解けなかったのではと思います。 机についたCBBのシミを落とすのも、水よりはエタノールの方がすぐに拭えますからね。 つまり、蒸留水を脱色とするのはあまり賢明ではないということになります。 熱水だと多少はマシかもしれませんが、アクリルアミドゲルが脆くなるので、そこは注意です。
お礼
回答ありがとうございます CBBの溶媒への溶解度についてですが、私が実験をして確認をしたところ5% TCA溶液へ溶解可能です。ただし、溶解度はそれほど高くはないです ひとつお聞きしたいのですが 溶解度が低いことが定量解析にも問題となるのでしょうか つまり、溶媒へのCBBの溶解度が低いことは脱色効率の低下だけでなく、定量解析の精度低下にもつながるのでしょうか よろしくお願い致します
TCA溶液ってタンパク質の変性作用がとても強いので、 そんなものを使ったら定量分析にならないように思います。 CBB染色の感度が弱いのであれば、より感度の高い銀染色 を検討すべきではないでしょうか。
お礼
回答ありがとうございます タンパク質への強い変性作用があることがいけないとのことですが、このことに関する以下の疑問点について教えていただけますか ゲル内のタンパク質はSDSと混合した際に、すでに完全に変性していると思います そもそも、脱色液に含まれている有機溶媒はタンパク質を変性させ、析出させることが目的だと思うのですがいかがでしょうか もしくは、変性作用が強すぎると、タンパク質量の定量解析に悪影響を及ぼすということでしょうか また、銀染色についてですが、定量解析を行いたいので現在のところ検討はしておりません よろしくお願いいたします
関連するQ&A
- 有機溶媒を染色せず、水だけを染色できる色素
酢酸エチルをエタノール、酢酸と硫酸を触媒にして合成する実験で、分液漏斗でデカンテーションしていくんですが、分液漏斗で酢酸エチルの純度を保ちつつ、収率をあげるのがむずかしくて。。 で、有機溶媒の水とかだけを染色する色素を使うのはどうかなと思ったんですが、そのような色素はありますか？
- 締切済み
- 化学
- FAT RED 7B染色について
私は今15％ＳＤＳーＰＡＧＥ電気泳動でＨＤＬを電気泳動しているのですが、脂質の存在を調べるのにＦＡＴ ＲＥＤ ７Ｂ染色をするように言われています。コレステロール染色でもよいとは思うのですが当染色でポリアクリルゲルを用いた染色を希望されています。しかし染色液や脱色液の組成や分量は本などに書いてあるのですが、染色の仕方がかいてありません。何度か自分なりに染色時間を考えて染色してみたものの、そまりません。詳しい方法をご存じないでしょうか。
- 締切済み
- 化学
- 溶液が白くにごります
有機溶媒（ヘキサンや酢酸エチル）で抽出した抽出物をエタノールに溶かしたのですが、溶液が白くにごってしまいました。100%エタノールには問題なく溶けるのですが、水を少し混ぜた70%エタノールなどだと白くにごってしまいます。遠心分離してみても状態は変わりませんでした。原因として、どのようなことが考えられるでしょうか？
- ベストアンサー
- 化学
- HPLC用緩衝液の作成方法に関して
HPLCで用いる緩衝液に、有機溶媒が含まれている場合の作成方法で困っています。 一般的に、緩衝液を作成し、pHを調整してから、そこに別のメスシリンダーで計量した有機溶媒を加えるということは把握しています。 例えば、「20mM KH2PO4/K2HPO4バッファー,pH7.0/メタノール=40/60」とあった場合、20mmolの塩を溶かしたpH7.0の緩衝液1Lを作成し、そこから400ml分取してメタノール600mlと混合するのか、それとも、20mmolの塩を溶かしてpH7.0に調整した緩衝液を400mlにメスアップし、そこに600mlのメタノールを加えるのでしょうか？ 宜しくお願いします。
- ベストアンサー
- 化学
- 電気泳動に時間がかかる
ウエスタンブロッティングを始めたのですが、電気泳動がうまくいかなくて困っています。 20mAの定電流で行っているのですが、電圧は16V程度しか上がらず、数時間経っても泳動しません。電流を200mAくらいまで上げていくと少しずつ流れますが、それでも5~6時間かかります。ゲルを染色するした結果、一応サンプルが流れていることは確認できました。 以前は20mAを1時間＋40mAを1時間の2時間で終了できていたのですが、最近になってうまく泳動ができなくなりました。原因は何なのでしょうか？ ゲルの組成としましては モノマーストック溶液（Aclylamide PAGEとN,N-Methyllene-bisacrymideをDWで溶解）、４×分離バッファー（1.5M Tris-HCl,pH8.8)、４×濃縮バッファー（0.5M Tris-HCl,pH6.8）、10%SDS、DW、18%APS、TEMED をアクリルアミド濃度10%になるよう調製しています。 また、サンプルは筋のホモジネートを検体処理液と等量混ぜて、4～5分boilしています。 周りに分かる人がいなくて独りで試行錯誤しているのですが、何が原因だか分からず困っています。よろしくお願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
- 薄層クロマトグラフィーの展開溶媒について。
学校での有機化学実験で、 サリチル酸からサリチル酸メチルとアセチルサリチル酸を合成して、サリチル酸（標準溶液）・アセチルサリチル酸・サリチル酸メチルそれぞれをスポットし クロロホルム：メタノール＝９：１（ＣＭ溶媒）と クロロホルム：メタノール：酢酸＝９４：５：１（ＣＭＡ溶媒）で展開しました。 この物質と溶媒がどのような関係で分離されているのかが分かりません。 ベンゼン環以外の－ＯＨ，－ＣＯＯＨ,－ＯＣＯＣＨ3,－ＣＯＯＣＨ3の違いなのでしょうか？ また、この場合なぜ展開溶液にメタノールや酢酸を用いるのでしょうか？ 文献やインターネットで探してみたものの、見つからなくて、考えてもどうも答えが見えてこないので・・・。 もし良かったら答えてください。よろしくお願いします。
- 締切済み
- 化学
- 染色について
染色体をシマシマにする染色法のプロトコールなんですが、 トリプシン処理法 1．標本作製後、37℃で一晩乾燥する。 2．0.25%トリプシン溶液をPBS(-)で10倍に希釈し、0.025%溶液を作製する。 3．標本にPBS(-)で希釈した0.025%トリプシン溶液を0.5mlマウントし、15～30秒放置。 4．PBS(-)に浸しトリプシンの反応を停止する。 5．50%メタノール溶液でメタノール媒染（マウントして5分間）し、37℃で乾燥させる。 6．(pH 6.4)PBSで希釈した5%ギムザ染色液をマウントし3分間染色する。 7．RO水で洗浄して37℃で乾燥させる。 8．ソフトマウントとマニキュアで封入し、室温で1時間ほど乾燥させる。 9．顕微鏡で観察する。 この方法で染色を行っても染色体が膨化（フヤフヤ状態）してしまい、また染色体がかなり短くなってしまいます。中にはうっすらシマシマに染色されているものもあるんですが、このレベルでは染色体番号順にならべるにはかなり難しいっぽいです。よく人の染色体の写真が教科書などに載っていますがあんな感じにきれいな標本を得るにはどうしたらいいのでしょうか？？なんでもいいので助言をよろしくお願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
- ブラッドフォード法と電気泳動法について
タンパク質の学生実験で課題を出されて困っています。 １）なぜ色素結合法を用いて各分画中のタンパク質の定量をあまり行わないのか ２）試料溶液が全部カラム中のイオン交換体（カラムベッド）に入った後、なぜカラムの平衡化で用いたのと同じ緩衝液でカラムを洗浄する必要があるのか ３）タンパク質はなぜゲルの中を電気的に泳動することができるのかを考察せよ 実験ではＢＳＡを標準試料として未知試料の定量や、イオン交換クロマトグラフィー、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動などをしました。 専門家の方々にとっては非常にばからしい質問かもしれませんが、どうかよろしくお願いします。
- 締切済み
- 生物学
お礼
回答ありがとうございます 評価法について、様々なご指摘ありがとうございます 本実験の都合上、この手法で続行しようと思います 私自信もCBB染色後にフリーソフトを用いてバンドの定量化を行い、この結果を元にタンパク質の定量化を行おうと考えていたところです笑 おかげさまで、懸念点が解決して実験が一つ前進しそうです ありがとうございました