脳内モノアミンの定量

質問

こんにちは！４月から新大学院１年になる学生です。
宜しくお願いいたします。
皆さま方に教えていただきたいことがあります。
現在、薬物投与後の脳内モノアミンの変化を調べているのですが、
現在の実験法では上手く定量することができなく困っております。

薬物投与後、マウス脳を取り出し、過塩素酸 (0.6 N) 中にてホモジナイズ（ガラス製のホモジナイザーを用いて）します。
遠心を行い、得られた上清を中和処理したものに、DABS-Cl (ダブシル-クロライド) を加え、ダブシル化を行います。
このものをＨＰＬＣ分析 (カラム：ODS，検出：436 nm) し、アミンの定量を行っています。
アミン-DABSの結合体を、可視光を照射することでピークとして検出しています。

現在、ＧＡＢＡの定量を行っているのですが、ＧＡＢＡのピークはみられるだけで、
negative, positive control間で全く差がみられず、正確な定量データが得られません。

この実験の欠点、改善点がありましたら、ご指摘願えますでしょうか。
また、この方法以外に有用な定量方がございましたら、アドバイスを宜しくお願いします。
お力添えのほど宜しくお願いいたします＾０＾

回答No.3

taronbe · ベストアンサー

蛇足ながら・・・
興奮アミンはGABAと同様に栄養物質としての側面があり、細胞外に放出されたものを灌流などで測定すれば神経活動を拾えますが、組織をホモジナイズした場合神経活動との関連を解釈する事が難しくなります。むしろドパミンの前駆体であるチロシンかセロトニンの前駆体であるトリプトファンを測定してみたほうが結果が出るかもしれません。その濃度はGABAと比較して極端に少なく、従って神経伝達の変化を反映しやすくなりますので。

お礼

この度は大変ご丁寧に教えてくださり、本当にありがとうございます！
色々と検討を重ねて、上手く結果が出るように実験を進めていきたいと思います。
是非またお力添えを宜しくお願いいたします＾０＾
この度はありがとうございました！

回答No.2

taronbe

僕も似たようなことをやったことがあるというだけで、どこまで適切なのかはよくわからないのですが・・・
１一般的にGABAはモノアミンの中には入らないと思いますが、モノアミンとはまた別に測定しているということでしょうか？
２GABAはモノアミンと違って栄養物質としての側面を持ちます。細胞外液で測定するのであれば神経伝達と関連するでしょうが、組織をホモジナイズした場合、神経伝達と関連するGABAはおそらくそのうちの極一部です。何の薬剤を使ったかはわかりませんが、もしそれがGABAの合成や代謝ではなく神経伝達に関連するものであれば、有意差が出ることはないと思われます。
３モノアミンやGABAを研究していることから、おそらく神経伝達と関連する研究であると思われますが、それはおそらく脳や神経核の部位によって変わってきます。脳は脂質が多くてホモジナイズが難しいこともありますので、特定の部位だけに研究対象を絞り、そこだけホモジナイズするようにしたらどうでしょうか。
４ロイシンは脳内にも存在しますが、内標準としては適切でしょうか？

補足

早速のご返答・ありがとうございます！
鎮静効果を目的に使用される薬物を投与し、投与後の体内変化の1つとして、脳内アミンを定量しました。
興奮アミンであるアスパラギン酸，ここで取り上げたＧＡＢＡを含め、
ＨＰＬＣを用いると、多くのアミノ酸を定量することができると文献にありました。
参考にした文献において、内標準としてロイシンを用いていたので、
まずは文献通りの方法で実験を行いました。
脂質が多いことから、ホモジナイズが難しかったんですね＞＜
特定の部位を取り出して、今後検討したいと思います。
大変参考になるご意見をありがとうございました！

回答No.1

taronbe

negativeとpositive controlでは具体的に何をしているのでしょうか？ダブシル化を行わないでHPLCにかけているとかでしょうか。
あと定量するとして単位はなんでしょうか？/脳か/proteinか/gですか？あるいは内部標準を使っていますか？

補足

ご回答、ありがとうございます！
positive controlは、ＧＡＢＡ濃度を上昇させる薬物を投与したマウスであり、
negative controlは薬物を溶解した溶媒（生理食塩水）を投与したマウスを指しています。
内標準物質として、ロイシンを用いており、定量単位は「mol(amine)/mg(brain)」となっております。
お聞きしたいのですが、ダブシル化を行ってのアミンの定量は、一般的でしょうか。
また、ガラス製ホモジナイザーを使ってホモジナイズした際、ガラス壁面にすりつぶしカスがどうしても残ってしまい、
全量回収がとても困難です。
最後に、この実験では全脳を用いてアミンを抽出していますが、ＧＡＢＡに絞った場合、
中脳のみを取り出すのが良いと聞いたことがあります。
taronbeさんなら、どのように工夫を考えられますか？
改良点など、ぜひアドバイスをお願いいたします。