HPLCのベースラインと定量について。

質問

私は今、大学院でHPLCを使いレチノイドの定量をしています。
基本的なHPLCの条件として、カラム：ODSカラム、移動層：85%メタノール+10mM酢酸アンモニウム、流速：1mL/min、検出波長：325nm
で測定を行っています。
比較的、逆相で早く出てくるレチノールなどの物質はこの条件で測定していますが、レチノイドの中でも脂溶性の物質をこの条件で測定しようとすると、保持時間が長くなってしまい、1サンプルの測定にかかる時間が長くなってしまいます。
そこで、文献にのっている条件で、グラジエントをかけて測定してみることにしました。
その条件は、
移動層：acetonitrile：tetrahydrofuran：water＝50:20:30と50:44:6の二相でグラジエントをかけていくというものでした。
しかし、その条件で実際に測定してみると、ベースラインが丘みたいにカーブを描き、そこにピークがでるという結果でした。
以前、ベースラインが水平でないところのピークの定量結果は正確ではないと聞いたことがあります。
やはり、そのような結果では、正確な定量と言えないのでしょうか。
また、グラジエントをかけるとベースラインはある程度上がってしまうものなのでしょうか。

まわりにHPLCの助言をしてくれる人がいないので、悩んでおります。
非常に基本的な質問で申し訳ありませんが、助言を頂ければと思います。
よろしくお願い致します。

回答No.2

caesart · ベストアンサー

グラジエントをかけてもベースラインは大体安定するものですが・・・。
参考にされた文献に標準チャートの例は載ってませんでしたか？
そのチャートのベースと実際にご自分でデータを取ったチャートを比べられればいいのですが。
グラジエントをかけて溶出する位置のアセトニトリル：テトラヒドロフラン：水の比率が大体どのくらいかは計算で出せるので、その比率の移動相を作ってアイソクラティックで測定してみては？

お礼

回答をありがとうございます。
お礼が遅くなり申し訳ありません。

参考にした文献には、標準チャートの例が載っていなかったのです。

グラジエントをかけて溶出する位置の移動層の比率を計算して、その比率の移動層をつくり、アイソクラティックで測定するということは考えつかなかったので、このままなかなか安定しないようなら試してみようと思います。

回答No.1

elpkc

グラジエントをして分析した場合、ベースラインの変動は仕方ないことですが、
同じカラムで何度も分析していくに連れて、安定してくる場合もあります。

定量性がいいかどうかは、その条件での、分析の精度、真度を確認するしかないです。

お礼

回答をありがとうございました。
お礼が遅くなり申し訳ありません。

根気よく同じカラムで何度も分析して、様子をみることも必要だということですね。
もう少し時間をかけて分析していこうと思います。