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またまたHPLCで教えてくださいな!

  • 困ってます
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お礼率 73% (259/353)

えっと、HPLCのベースラインのことでお尋ねします。

ズバリ、ベースラインが安定しません。
午後中流していたのですが、ずーーーーーーっと下がって(という言い方でいいのかな?)いくのです。
蛇行したりするのではなく、とにかく下がり続けるのです。

移動相をメタノール・アセトニトリル・リン酸緩衝液のものから
メタノール・アセトニトリル・クエン酸緩衝液に変えたところでこの現象です。
セルに気泡が入ってるのかなー、とも思いますが昨日までちゃんとラインは安定していて、
カラムも変えてないし、一応脱気装置もついてるし・・・。

いったい何が原因なのでしょうか?
ちなみに測定物質は安息香酸です。

ちょっとでもヒントになることがあれば、ぜひぜひご教授ください。
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質問者が選んだベストアンサー

  • 回答No.4
レベル9

ベストアンサー率 42% (23/54)

>>溶離液を頻繁に変えての系内洗浄は必ずカラムを外した上で行ってください。
>えっ、そ、そうなんですね・・・。(^^;)
>すいません、知らないことだらけで・・・。

カラムや溶離液の種類によって差異はありますが、頻繁に溶離液や圧を変更するとカラムの寿命が短くなります。カラム内の溶離液を交換する際は流量(圧)を下げ、時間をかけて穏やかにやるのが基本です。

rei00さんもおっしゃるように水で充分に洗浄したほうがよいでしょう。いきなりメタノールを通すと無機塩が析出してしまう可能性も生じてきますから。水で洗浄後、水/メタノール混合溶液→メタノール→水/メタノール混合→水、最後に使用する緩衝液といった順番で流せばいいように思います。有機物が付着している可能性があるのならば、メタノール洗浄後にアセトニトリルや場合によっては2-プロパノールで洗浄するのもいいかもしれません。


rei00さん、こんにちは。
>>溶離液を流しっぱなしにしておくと自然に問題が解決
>>することもよくあります(答えになっていないけど)。
>これは溶離液を流しっぱなしにした事で,系内の溶離液交換が完了した結果だと思いますが。いかがでしょうか。

そうですね。私が体験したトラブルの原因は、ほぼ100 %これによるものと考えています。
お礼コメント
zikkentyan

お礼率 73% (259/353)

お礼、遅くなり申し訳ありません!!
細かいご指導ありがとうございます!

早く技術が進んで溶離液にカラーがついたりしてて、
外観で「あ、今溶離液がちゃんと交換できた!」とか確認できる時代になればいいなぁ~
なんて希望を抱いてしまいますねぇ。
え?それよりもちゃんと勉強した方が早い??
ごもっともです。(^^;)

とにかく週明け、がんばってみます。
投稿日時 - 2001-11-04 22:53:31
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その他の回答 (全3件)

  • 回答No.1
レベル9

ベストアンサー率 42% (23/54)

順相で検出波長が比較的短い場合に同様な経験をしたことがありました。 私自身はきちんと答えられるほどの知識は無いのですが、もう少し情報があると皆さん答えやすいように思います。 検出器はUVですか? 波長は(安息香酸ということで大体予想はつきますが)? ポンプ圧が徐々に変動するようなこと(脈流とは違います)は無いでしたか? ランプの寿命はどうでしょうか? 安息香酸の保持時間やピーク形状に変動は見ら ...続きを読む
順相で検出波長が比較的短い場合に同様な経験をしたことがありました。

私自身はきちんと答えられるほどの知識は無いのですが、もう少し情報があると皆さん答えやすいように思います。

検出器はUVですか? 波長は(安息香酸ということで大体予想はつきますが)? ポンプ圧が徐々に変動するようなこと(脈流とは違います)は無いでしたか? ランプの寿命はどうでしょうか? 安息香酸の保持時間やピーク形状に変動は見られませんか? 測定室の温度変化、というよりも測定温度の変動はありませんか? カラムヒーターがついていてもカラムから検出器までのラインが剥き出しでエアコンの風があたってたりするとアウトです。そして移動相交換時の系内の置換は確実ですか? 

こんなことを言うのは失礼ですが、移動相を変更した際にトラブルが起きるのは系内が充分に置換されていない理由によるものが多いです。緩衝液を使用していると無機塩の追い出しにだけ気をとられてしまいがちですが、有機溶媒のみでも洗浄したほうが良い場合も多々あります。検出器の種類にもよりますがセル近辺には結構汚れがたまりやすいので不安でしたらマニュアルに従って分解→洗浄確認することも重要かと思います。ベースラインに変動をもたらすほどではないにしても、ヤニ化している微量成分のこびりつきは稀にあり、これがピークとして現れたりすると分析自体が無効になります。

とりあえず思いついたことだけ記しました。
お礼コメント
zikkentyan

お礼率 73% (259/353)

詳しいアドバイスありがとうゴザイマス!

検出器はUVで、ポンプ圧は正常、ランプ寿命もオッケー、
測定温度もおそらくは大丈夫だと思います。

ということは置換が問題なのですかねぇ??
一回メタくらいで洗浄をやってみることにします。

本当に、ほぼ独学でやってるので知識がなくてすいません。
アドバイスとてもありがたいです。
投稿日時 - 2001-11-02 10:40:29


  • 回答No.2
レベル9

ベストアンサー率 42% (23/54)

念のため申し上げておきますが、溶離液を頻繁に変えての系内洗浄は必ずカラムを外した上で行ってください。カラム内の溶離液交換の際は、マニュアル記載の方法に従ってください。グラジェントが出来るとベターなんですけどね。 検出器の耐圧限度にもよりますが、検出器の出口に不要カラムを接続し、背圧をかけて洗浄すると効果的な場合もあります。 ただし分析用カラムがベースライン不安定の原因である場合には、それ以外の ...続きを読む
念のため申し上げておきますが、溶離液を頻繁に変えての系内洗浄は必ずカラムを外した上で行ってください。カラム内の溶離液交換の際は、マニュアル記載の方法に従ってください。グラジェントが出来るとベターなんですけどね。

検出器の耐圧限度にもよりますが、検出器の出口に不要カラムを接続し、背圧をかけて洗浄すると効果的な場合もあります。

ただし分析用カラムがベースライン不安定の原因である場合には、それ以外の部分をいくら洗浄しても安定化にはつながりませんから注意してください。

いずれにせよ原因不明のままでも溶離液を流しっぱなしにしておくと自然に問題が解決することもよくあります(答えになっていないけど)。
お礼コメント
zikkentyan

お礼率 73% (259/353)

>溶離液を頻繁に変えての系内洗浄は必ずカラムを外した上で行ってください。
えっ、そ、そうなんですね・・・。(^^;)
すいません、知らないことだらけで・・・。

>いずれにせよ原因不明のままでも溶離液を流しっぱなしにしておくと自然に問題が解決することもよくあります
不思議となぜかそういうことってありますよね。

今回はものぐさせずにメタを流してみます。ありがとうございました。
投稿日時 - 2001-11-02 10:44:23
  • 回答No.3
レベル14

ベストアンサー率 50% (1133/2260)

 Organomets さんのお書きの様に,系内の溶離液交換が不十分なように思います。「メタノ-ルを流してみる」との事ですが,緩衝液を使用されている事を考えると,水での洗浄もされる方が良いかも知れません。  なお,溶離液を交換する際には,直接新しい溶媒に変えるのではなく,両溶媒と双溶性のある溶媒に一旦交換してから目的の溶媒に変える方が安全です(もちろん,新しい溶媒自身が双溶性があれば直接変えても構い ...続きを読む
 Organomets さんのお書きの様に,系内の溶離液交換が不十分なように思います。「メタノ-ルを流してみる」との事ですが,緩衝液を使用されている事を考えると,水での洗浄もされる方が良いかも知れません。

 なお,溶離液を交換する際には,直接新しい溶媒に変えるのではなく,両溶媒と双溶性のある溶媒に一旦交換してから目的の溶媒に変える方が安全です(もちろん,新しい溶媒自身が双溶性があれば直接変えても構いません)。特に緩衝液を使用している場合は。

 以前の質問「QNo.153029 HPLC初心者です!」(↓)でご紹介したカラムメ-カ-のペ-ジに溶離液交換時の注意事項なども載っていたと思います。ご覧になってみて下さい。

Organomets さん
> 溶離液を流しっぱなしにしておくと自然に問題が解決
> することもよくあります(答えになっていないけど)。
 これは溶離液を流しっぱなしにした事で,系内の溶離液交換が完了した結果だと思いますが。いかがでしょうか。
お礼コメント
zikkentyan

お礼率 73% (259/353)

お礼遅くなり申し訳ありません。

それにしても今まで溶離液の交換にここまで気を使ってなかったんで
ちょっと今までのことが心配になってきました。(^^;)

とにかく、月曜は水の洗浄から始めますね!
ありがとうございました!!
投稿日時 - 2001-11-04 22:48:46
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