DNAのゲルからの切り出しについて

質問

DNAのアガロースゲルからの切り出しで、2つのバンドが隣接して、切り出しが難しいときはどうすれば良いか教えてください。（ちなみに約4000ｂｐと約3000ｂｐ）どうぞよろしくお願いします。

回答No.3

etitengam

3kbと4kbでしたら0.8%等の薄めのアガロースで電気泳動すれば分離できます。私は0.5x TAEでゲルを作り泳動バッファーもこれを使っています。Mupidで100V 30min.程度流すとローディングバッファーの青いバンドがゲル全体の７割くらいまで移動するので、そうしたらゲルをエチブロ溶液に１時間漬け、ゲル撮影装置で観察します。泳動時間を長くすればバンドがより分離してきます。

回答No.2

yuklamho

アクリルアミドゲルはアガロースゲルに比べて特に低分子量の分離度が良かったりいろいろ利点はあるのですが、周りにやられた方がいらっしゃらなかったらアガロースゲルでやられたらいいと思います。

アクリルアミドゲルの作り方はアクリルアミドとAPS、TEMED、TAEもしくはTBEバッファーで5%くらいの濃度で作って流した後EtBrで1minくらい染色してUVで観れます。バンドの精製はバンドを細かくして（砕く？）TEバッファーを加えてボルテックスして37度で1-2hrか4度で一晩インキュウベートしてフェーノール・クロロフォルム抽出、クロロフォルム抽出、エタ沈です。

お礼

お返事が遅くなりすみません。
他の酵素で消化できました。これでトランスジェニックにもっていけます。
ありがとうございました。

回答No.1

yuklamho

１）要る方のバンドになく要らない方のバンドにあるサイトの制限酵素で、要らない方のバンドを消化してから電気泳動して切り出す。

２）アクリルアミドのゲルで長めに流して切り出す（こちらの方が分離はいいので）。

どうでしょうか？

お礼

酵素で余分なカ所を消化してみます。ありがとうございました。

補足

ご回答ありがとうございます。制限酵素サイト、調べてみます。
それと、アクリルアミドはタンパクのみと思ってたのですが、DNAも流せるのですね。この場合、染色はエチブロで、ジーンクリーンキットで抽出でよいのでしょうか？初心者なので、すみません。