免疫沈降法を用いた実験手法

質問

２つのタンパク質（A,Bとする）が１つの複合体を形成していることを証明する場合

免疫沈降（anri-A抗体）→Western blot（anti-B抗体）

という手法を用いますが、３つのタンパク質（A,B,C）が１つの複合体を形成しているのを証明する場合

免疫沈降（anti-A抗体）→cross link解除（95℃　10分）→二度目の免疫沈降（anti-B抗体）→Western blot（anti-C抗体）

という手法を行ったと論文で書かれておりました。この（95℃ 10分）という作業でanti-A抗体を変性させるにしても、目的とするタンパク質も一緒に変性してしまう可能性があるのではないでしょうか？
もしこの手法が正しいのならば、95℃でタンパク質が変性しない理由も教えて下さい。

回答No.1

wriwri · ベストアンサー

AB複合体の場合はお書きになっている方法で証明できます。

ABC複合体もそれを応用すれば、
IP（Anti-A)→WB：Anti-B とAnti-Cで行けます。

おそらく、Anti-B抗体がWBで使えないために、二段階目でAnti-BでIPしてると想像されます。または、Anti-CがIPで使えなくてWBでしか使えないという可能性もあります。いずれにせよ、９５C１０分の目的は、抗原をAnti-A-アガロースビーズから遊離させることです。私も同様の方法で２段階IPをしたことがありますが、２段階目のIPはうまく行っているのでエピトープは保存されていると予想されます。ただし、抗原全体の構造変化についてはわかりません。もし、エピトープの変性の可能性があるのなら抗体の順番、あるいは抗体自体を変えるのも一法ですね。

ふと気になったのですが、”Cross-link解除”と論文に書いてあるのならば、もしかしてCross-linking試薬で複合体ABCを抽出しようという試みではないかとも予想されます。

老婆心ながら、Co-PIをする場合には多くのコントロール抗体が必要になることと、Detergentの選択が成功の可否を決めることをご忠告いたします。

お礼

回答ありがとうございます。
そうですねCo-IPをする場合は多くのコントロール抗体を必要となりそうですね。
今回質問させていただいた理由の１つは「Co-IPはトラブルシューティングが難しそう」というものです。
最後のWBでバンドが検出されなかった場合、95℃処理が問題なのか、抗体に問題があるのかなどいろいろな問題が考えられます。これを解決するためにはいろいろな抗体（認識部位の異なる or 他社）を用いて実験をしなくてはいけないんですが金銭的にそれほどの余裕は無くうちのラボでは避けているのが現状です。

回答No.2

wriwri

そうですか、研究費の問題があるのでしたら、支出を最小限にするためにIPに使える抗体とWBに使える抗体、双方に使える抗体を調べて貰えるものは貰う、買えるものは買うとするのがいいでしょうね。もちろんコントロール抗体も含めてですが。

もしくは、再度検討して本当にCo-IPが必要なのかも話し合う必要もありそうです。例えば、IFでConfocal下での観察も一つの方法かもしれません。