実験経験の浅い者です。初めて質問します。
細胞質、細胞膜上で発現しているあるタンパクに対する抗体を作成中です。既報にならって、合成ペプチドから抗体(血清)を作成しました。
目的の抗体ができているかを確かめるために、ELISA、ウエスタンブロット、免疫染色をしたのですが、ELSA、免疫染色は問題なく、ウエスタンブロットだけうまくバンドがでませんでした(非特異的なバンドのみ)。
発現しているはずの細胞を抗原としてβ-メルカプトエタノール、SDS入りのサンプルバッファーで溶解処理して、通常のSDS-PAGE、1次抗体は血清、2次抗体はWB用の抗体を使用しました。
免疫染色では、血清を2000倍希釈しても十分染色できました。
高次構造が変わると抗原性がなくなってしまうということなのでしょうか。
だとすると、ウエスタンブロットでは、還元剤なしにするとよいのでしょうか？何かよい方法はありますでしょうか。
よろしくお願い致します。
投稿日時 - 2010-03-02 13:39:18
膜蛋白質ということですが、泳動前にボイルしていますか？
多回膜貫通蛋白質の場合、ボイルによって凝集し、
SDS-PAGEで分離されなくなることがよくあります。
その場合は37℃で１時間くらいインキュベートすればOKです。
むしろ免疫染色の陽性反応がノンスペという可能性もありますが、
RNAiなどで確認されましたか？
もしくは、ご推察のとおり高次構造が壊れると抗原性を失うのかもしれません。
その場合はそもそもSDSで高次構造を破壊することが前提のSDS-PAGEでは難しいですね。
投稿日時 - 2010-03-16 17:11:20
お礼
御返答ありがとうございます！
御指摘のとおり、多回膜貫通型の蛋白で、泳動前にボイルもしていました。今度、教えて頂いた37℃の方法でやってみたいと思います。
また、免疫染色がノンスぺである可能性ですが、かなりあると思います。一応ネガティブコントロールは確認しましたが…。
だからポジティブかといわれれば、WBも失敗しているのでかなり疑わしいです。
RNAiは施行していません。
きちんと確かめるなら必要かと思いますので、やってみたいと思います。
いろいろありがとうございました！
参考にさせて頂きます！！
投稿日時 - 2010-03-16 20:21:49
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