- ベストアンサー
ダブルダイジェストできない制限酵素反応
- みんなの回答 （2）
- 専門家の回答
質問者が選んだベストアンサー
>。一回目の反応→フェノクロ、エタ沈→二回目の反応というやり方でやる場合、フェノクロを省くことは可能でしょうか？ バッファー交換するとき注意すべきは、前の酵素が失活していないと、至適ではないバッファー中でスター活性がでる場合があることです。 たいていの酵素はエタ沈で失活するので、フェノール抽出はいりません。 エタ沈で失活するか、フェノール抽出が必要か、熱失活できるかなどは、たいていのメーカーカタログに書いています。 また、L, M, Hのように主に塩濃度の違うバッファーで二重消化する場合は、塩濃度の低いほうの消化をしてから、高いほうの塩濃度に調整して次の消化をすればいいです。至適塩濃度の低い酵素が高い塩濃度に入った場合は、切れなくなるだけでスター活性の原因にはならないので、途中で失活させる必要はありません。諸般の事情で塩濃度高→低の順番に消化しなければならない場合は、最初の消化のあと、熱失活ができるなら、塩濃度を薄めて次の酵素で消化をすることができます。
その他の回答 (1)
- otx
- ベストアンサー率44% (256/576)
こういうことはメーカーのカタログに、たとえばTAKARAのカタログなんかは、相当詳しく書いてあります。 学生でも、まずはそこをチェックします。 ご自分で調べられてはいかがでしょうか？
補足
タカラのカタログにありました。見落としていたようです。失礼しました。
関連するQ&A
- 制限酵素反応後の保存
制限酵素反応終了後、フェノクロ、エタ沈をせずに、冷凍保存するケースがあると思うのですが、これってどのくらいの期間保存可能なんでしょうか？土曜に反応させたものを翌週の月曜まで冷凍保存することは問題ないでしょうか？多分大丈夫とはおもうのですが、ご意見お聞かせくだされば幸いです。
- ベストアンサー
- 生物学
- 酵素処理（ダブルダイジェスト）
いつもお世話になっております。 ダブルダイジェストでの制限酵素処理について教えて下さい。 現在、発現ベクターへのクローニングを、PCRproductを制限酵素処理→ベクターへ導入のプランで行う予定でいます。 その際、同時に行えるようにと、同じバッファーが使用可能な制限酵素を選択しました。 と、ここまではいいのですが、ある人からPCRproductとベクターを１チューブに入れて酵素処理を行う事が出来るという事を聞きました。 これが可能であればすごく手間が省けて言いと思うのですが、本当にその様なことは可能なのでしょうか。 また、実際にそれを行う場合の条件はどの様なるのでしょうか？ （当方では制限酵素はHindIII・KpnIで、Mバッファーを使用しようと思っております。） もしこの様な方法をご存じの方、もしくは実際に行われたりされている方がいらしたら教えて下さい。 宜しくお願い致します。
- ベストアンサー
- 生物学
- PCR産物4の制限酵素処理について
ヒトの細胞からゲノムDNAを抽出し、PCRにて増やしたDNAを制限酵素処理しているのですが、上手くいきません。どなたかご指摘の方お願いします。 制限酵素名：KpnI 10×L buffer 1μL PCR産物（フェノクロ処理、エタ沈、真空乾燥し滅菌水に溶かしたもの) 8μL KpnI 1μL 反応時間：1時間 これで行っているのですが全く切れません。試しに一日置いたのですが、全く一緒でした。 ちなみにKpnIは別の人が、プラスミドを切るのに使って、成功したので、失活はないと考えられます。 また、PCR産物も確認したところ目的とするものでしたので、PCRは成功してます。
- 締切済み
- 生物学
- 制限酵素の取り扱い
制限酵素を使った実験を行いました。 多くの制限酵素は－20℃で保存されており、チューブに加える時も温度を上げないように注意されました。 しかし、最終的には37℃(酵素の至適温度)で反応させています。 制限酵素を加える時は温度を上げないように注意するのはなぜでしょうか？失活を防ぐためですか？しかし、それなら37℃では失活してしまうようにも思います。 また、次のような操作は可能でしょうか？ (1)チューブにDNA、制限酵素等を全て加えたところで中断して、－20℃で保存する。 (2)反応速度を上げるために、37℃で一時間のところを47℃で30分で行う。 どなたか教えて下さい。お願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
- 今度は・・制限酵素の失活についてなんですが。。。
毎回毎回すみません・・また実験がうまくいきませんでした・・・ プラスミドＤＮＡをEcoRI,BamHIの二種類の制限酵素を使用し、どのように切断されるかをアガロース電気泳動を行って、バンドの移動度を比べてみました。 １つは、EcoRIだけで切断し、もう１つは二種類の酵素で切断しました。 でも電気泳動ででたバンドはネガコンとして流した未処理プラスミドＤＮＡと同じバンドでした。通常移動度が遅くなったり、バンドが２本でるはずなのですが・・まったくありませんでした・・・ 制限酵素が失活して、切断できなかったのではないかと考察したのですが・・・酵素は熱を加えると失活してしまうため温めないように注意したのですが・・ 制限酵素が失活してしまう要因をどうか教えてください。実験で注意すべき点など教えていただければ今後の実験に役立ちます。ぜひ実験をして経験された事でもよいので教えてください。いつもいつも実験の失敗についてばかり質問してしまってすみません・・・ よろしくお願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
- 制限酵素の謎
(1)ある実験において、2種類の制限酵素を用いてあるDNAを切断しました（AとBとします）。16時間とかなり長く反応時間を与えたため、DNAバンドはゲルの下方に確認され、『これはスター活性が起きた』と判断しました。 (2)後日。 スター活性を恐れた自分は反応時間を10時間以内に抑え、同条件でもう一度制限酵素処理を試みました。結果、前回よりもゲル上方にバンドが確認でき、完全ではないが『スター活性はある程度改善された』と判断しました。 (3)そして昨日。 制限酵素A抜きに、BだけでDNAを切断する反応を時間別に行ないました(1h,3h,6h,9h,16h)。これは『制限酵素Bがスター活性を起し始める』と考えられる反応時間を明らかにするため行ないました。結果、長時間反応させたにも関わらず、どの反応時間でも問題なく切断が行なわれていました。 以上の実験より、自分はこの様に考えています。 ・(1)(2)において。２種類の制限酵素を用いたため、グリセロール濃度が上昇した。よってスター活性が起こり易く、反応時間別の影響が大きい。 素人考えですが、自分なりの解釈です。その他に考えられる理由や経験をお持ちの方、ぜひお聞かせください。m(__)M
- ベストアンサー
- 生物学
- 細菌ゲノムをプラスミドに組み込む
細菌ゲノム（Sphingomonasというグラム陰性菌）のゲノムを制限酵素で消化し、その断片をpUC18等のプラスミドにライゲーションし、大腸菌に導入しようと考えていますが、そこで教えていただきたい点があります。このような目的で細菌ゲノムを調整する場合、ＣＴＡＢによる多糖除去等する必要があるでしょうか。それとも、フェノクロ＆エタ沈（イソ沈）＆RNase処理で十分ですか？
- ベストアンサー
- 生物学
お礼
タカラのカタログにありました。結構失活したりしなかったりいろいろのようですね。