今度は・・制限酵素の失活についてなんですが。。。

質問

毎回毎回すみません・・また実験がうまくいきませんでした・・・
プラスミドＤＮＡをEcoRI,BamHIの二種類の制限酵素を使用し、どのように切断されるかをアガロース電気泳動を行って、バンドの移動度を比べてみました。
１つは、EcoRIだけで切断し、もう１つは二種類の酵素で切断しました。
でも電気泳動ででたバンドはネガコンとして流した未処理プラスミドＤＮＡと同じバンドでした。通常移動度が遅くなったり、バンドが２本でるはずなのですが・・まったくありませんでした・・・
制限酵素が失活して、切断できなかったのではないかと考察したのですが・・・酵素は熱を加えると失活してしまうため温めないように注意したのですが・・
制限酵素が失活してしまう要因をどうか教えてください。実験で注意すべき点など教えていただければ今後の実験に役立ちます。ぜひ実験をして経験された事でもよいので教えてください。いつもいつも実験の失敗についてばかり質問してしまってすみません・・・
よろしくお願いします。

回答No.2

geneticist12 · ベストアンサー

先の「プラスミドＤＮＡのい精製がうまくいきません・・・なぜ？」の質問内容と関連があると思いますので、まとめてここで。

１）ひょっとして、コンタミしていた偽者を精製したのではないでしょうか。大腸菌の増え方が殖えるのにいつもより時間がかかったとか、培養時間に比して菌の濃度が薄かったなどの兆候がありませんでしたか？

２）アルカリ処理が過剰で、プラスミドが変性したのかもしれません。大腸菌ゲノムが一本鎖に変性するけど、プラスミドが変性しないことでゲノムDNAが沈殿として取り除かれます。プラスミドまで変性してしまうと収量が悪くなります。また、プラスミドが部分的に変性してしまうことがありますが、そうなったら制限酵素が効かなくなります。アルカリ/SDS溶液の濃度、量、処理温度、時間は適当でしたか。

制限酵素は普通の保存、取り扱いでは失活することはほとんどありません。極端な話、室温で長時間放置しても大丈夫です。

お礼

試薬、大腸菌、酵素すべて、実験しなれている先輩が用意してくれてものなので、自分の作業ミスだと考えなおし、指摘された所に気をつけながらしなおしました。
たくさんの情報がとてもためになりました。
ありがとうございました。

回答No.3

MIYD

EcoRIでもエタ沈、イソプロ沈の後に70%エタノールでリンスしないと切れませんが
プラスミドの精製については大丈夫でしょうか。

*10bufferは何を使っているのでしょうか。

EcoRI,BamHIが両方失活したと考えるよりも
質問者さんの精製したプラスミドが汚くて切れないというほうがありそうな気がします。

だれか先輩が精製したEcoRI,BamHIサイトのあるプラスミド(pBluescriptなど)を貰って切ってみてはいかがでしょうか。

もし本当に失活していそうでも
可能ならば他のラボから制限酵素を借りて、
そちらでは切れるけど、自分のラボのものでは切れないという確認をしてから捨てたほうがいいと思います。

制限酵素が失活することはほとんどありませんが、
昔BamHIが失活していた時はそうやって確認しました。

次からは(次が無いほうがいいのですが)行った操作の条件を細かく書くと、
一般論ではない、質問者さんが行った実験についての問題点が指摘されると思います。

お礼

酵素が失活しにくいと知り、もう一度、言われて点など確認をしながら実験を行ってみました。
酵素じたい先生が使用しているものを使用したため実験を先輩についてもらいながら行いました。
初めてしたんで、ミスもたくさんあったと思います。
詳しく質問できなくってすみません・・・・今度からは、詳しくプロトコールを書いて質問する事にします。
指摘ありがとうございました。

回答No.1

panda_

ピペッティングが荒く、ぼこぼこと気泡を立てても失活します。
また、酵素に合う塩濃度のバッファーを使用しないとうまく切れません（スター活性がでる）。

プラスミド精製の腕が悪く、不純物が多いときも切れにくくなります。まあ、EcoRIなら相当汚いプラスミドでも切れると思いますが、、、

お礼

精製に関しても電気泳動結果や沈殿の色からきちんとできているようだったので、もう一度指摘された所に気をつけながら実験しなおしました。
情報ありがとうございました。