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細菌ゲノムをプラスミドに組み込む

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  • 質問No.121513
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細菌ゲノム(Sphingomonasというグラム陰性菌)のゲノムを制限酵素で消化し、その断片をpUC18等のプラスミドにライゲーションし、大腸菌に導入しようと考えていますが、そこで教えていただきたい点があります。このような目的で細菌ゲノムを調整する場合、CTABによる多糖除去等する必要があるでしょうか。それとも、フェノクロ&エタ沈(イソ沈)&RNase処理で十分ですか?
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質問者が選んだベストアンサー

  • 回答No.1
レベル7

ベストアンサー率 61% (8/13)

ありきたりの回答ですが、、、。

もし私なら、きれいに精製します。というのは、1)制限酵素で切る時に夾雑物があると、効率が悪くなる(非特異的切断の可能性もある)から、2)ベクターにライゲーションする時に夾雑物があると効率が低くなる可能性があるから、3)ライゲーションの際にべクターとインサートの量比をコントロールしなければならないので、夾雑物があると、正確にインサートの量を測れないから 等です。

誰でも思うことですが、きれいなDNAが大量にある方が実験をコントロールしやすいですよね。 

で、実験ですが、やってみれば案外、汚いDNAでも出来たりしますよね。只、ゲノムを全部カバーするライブラリーを作りたいのであれば、ちょっと大変でもがんばってきれいなDNAを使ってやった方が、将来的にも使えていいですよ(経験者談)。ちなみに、私は超遠心までかけました(そんな必要ないのかなー、、、)。
お礼コメント
noname#20560

レスを有難うございます。
超遠心までかけられたのですか。。。
そう考えると、CTABくらいで面倒くさがっていたらいかん、ということですね。。。
投稿日時 - 2001-08-23 08:55:59
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