- ベストアンサー
プラスミドの電気泳動
DNAがライゲーションされたプラスミドを大腸菌から抽出して電気泳動したのですが、酵素処理をしていないにも関わらず複数のバンドが表れました。特にプラスミドの大きさを超える大きなバンドが確認されましたが、これはなぜでしょうか? プラスミドがダイマーを形成しているからとも聞きますが、プラスミドは結合方法も含めてどのように倍数化するのですか? 又、プラスミドが何倍体になるかは決まっているのですか?ダイマーではなく、トリマーやテトラマーにはならないのでしょうか? 教えてください。よろしくお願いします。
- みんなの回答 (2)
- 専門家の回答
関連するQ&A
- PCR&電気泳動について
電気泳動について質問です。3種類のプラスミドDNAについて、同じプライマーを用いてPCRを行いました。このバンドを電気泳動してみたところ、2種類のプラスミドDNAに関してはクッキリと目的バン ドが出たのですが、残り1種類のプラスミドDNAの増幅産物にかんしては、薄い目的バンド➕スメアが観察されました。この原因として考えられるのは何でしょうか?自分が考えているのは、プライマーや酵素には問題がないと思うので(他2種類のプラスミドDNAのPCRはうまくいった。)、テンプレートのプラスミドDNAの精製度が低いと考えています。現にO.D値も1.72くらいだったので…。なので、プラスミドDNAの抽出からやり直そうかと考えています。 他に何か考えるべき要因があれば、ご教授お願いします!
- ベストアンサー
- 生物学
- プラスミドDNAの精製
シークエンス反応に使うプラスミドDNAを抽出したのですが、反応が十分に行かないのか、塩基配列をあまり読むことができません。サンプルのプラスミドDNAの純度に問題があるような気がするのですが、純度がよいDNAを抽出する方法を(経験)コツなどを含めてご教授願えますでしょうか。 プラスミドDNAは大腸菌から抽出します。シークエンス反応はサイクルシークエンス法です。泳動はアクリルアミドゲルで行っております。
- ベストアンサー
- 生物学
- プラスミドへのインサート長が予想と異なるのはなぜ
大腸菌で発現タンパクをつくるため、クローニングしています。PCRで増幅後、2つの制限酵素でプラスミド、インサートともに切断し、ライゲーション、コンピテントセルへの組み込み後、プラスミド抽出してから制限酵素で切断して長さを確認するのですが、インサートと異なる長さのものしか取れません。なぜでしょうか? たとえばインサート1kbなのに取れたものは1.2kbと0.9kbになっていました。 単なるコンタミネーションでしょうか?
- ベストアンサー
- 生物学
- 遺伝子組換え
ベクターは制限酵素で切断してインサートDNAを組み込むと思うのですが、制限酵素で切断したままのプラスミドは、ライゲーション反応で簡単に再結合してしまいますよね!そうすると組み換えられていないベクターが出来る割りあいが多くなるから、脱リン酸化してリガーゼがDNAに結合できるようにしますが、これは片方のDNAのみを再結合させるだけで、もう一方は大腸菌内で修復系酵素で修復されますよね。 リガ-ゼが修復するのは分かるのですが、大腸菌内で修復系酵素によって修復がどのようにされているのか分かりません。。。是非、教えて頂けたらと思い質問しました。 参考書などは、難しく書いてあります。初心者でも分かりやすい説明ですと、尚うれしいです!!
- 締切済み
- 化学
- プラスミドDNAのい精製がうまくいきません・・・なぜ?
形質転換をしてアンピシリン耐性の大腸菌から、プラスミドDNAをアルカリーSDS法により分離した所、精製したプラスミドDNAをアガロース電気泳動をしたら、バンドの蛍光がすごく薄く、少量のプラスミドDNAしか分離できませんでした・・・溶液も確実に加えていったつもりだったんですが・・・プラスミドDNA分離がうまくいかない原因がよくわかりません・・・どういうミスでそうなってしまうのか原因として考えられる事があったら教えてください。お願いします。 今プラスミドDNAを使う実験に興味がありいろいろしてるんですがうまくいかず・・自信喪失状態でして・・回答して頂いたら嬉しいです。お願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
- プラスミドDNA ゲル電気泳動 検量線について
プラスミドDNAを制限酵素で切断したのち、アガロースゲル電気泳動を行い、DNA断片から元のプラスミドDNAの全長を求める実験を行いました。そのとき、サイズマーカーDNAの検量線(横軸:移動度、縦軸:塩基対数)を作成したのですが、検量線の両端が直線ではなく曲線になってしまうのはなぜでしょうか?
- 締切済み
- 生物学
- 電気泳動でバンドが出ない理由(学生実験)
Transformationした大腸菌のプラスミドを抽出して、アガロースゲル電気泳動にかけてLigationなどがうまく行っているかどうかを確かめました。 大腸菌のコロニーに TE/RNaseA ↓ NaOH(アルカリ変性させた) ↓ NaOAc(中性に戻した 大腸菌のゲノム:ニックが入ってもとに戻らない、プラスミド:元に戻る) ↓ phenol/chlorophorm(ph層:大腸菌のゲノム 水層:プラスミドをふくむ) ↓ 水層をとりだしてisopropannol加える ↓ ethanol(洗浄) の順で操作を行った後、電気泳動しました。 しかし、私がやったサンプルはバンドがだいぶ薄くなってしいました。 その理由がわからず悩んでおります。 予想としては、phenol/chlorophormをいれて遠心をかけて油層と水層にわけたときに、二つの層の間に白い層(タンパク質が含まれているらしい層)があり、水層(プラスミド含)を取り出す際にそれをピペットで吸ってしまったことが原因だったのかな、と思っているのですが、その根拠などもわかりません。 どなたかわかる方がいらっしゃいましたら、教えてくださると幸いです。
- ベストアンサー
- 生物学
- BAC DNAの電気泳動
BAC DNAを精製し、EcoRI処理した後電気泳動でバンドを確認しました。 このDNAに、大腸菌ゲノムが含まれているかどうかを見たかったのですが、 BACはEcoでたくさん切れてしまうためよくわかりませんでした。 大腸菌がコンタミしているとスメアになるといいますが、BACの場合は どのように見たらよいのでしょうか。 たくさんあるバンドのバックが白っぽくなるのはゲノムのコンタミなのでしょうか。 うっすら白かったり、上のほうにバンドが固まってしまったり(長めに泳動はしているのですが)するのはゲノムなのでしょうか。 また、ゲノムのコンタミを調べるのに、何か良い方法があればご教授を よろしくお願いします。
- 締切済み
- 生物学
- FAXの送受信ができなくなったため、電源を切っても再起動できません。
- パソコンのOSはWindows10で、無線LAN経由で接続されています。
- 電話回線はeo光を使用しています。
お礼
回答ありがとうございます。とても参考になりました。