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いろいろ頑張っておられるんですね。 最初の回答で失礼なこと書いてしまいましたね。どうも申し訳ありませんでした。 一次抗体はポリクロなんですか。 とすると、例えば一次抗体の濃度を目一杯濃くしてやると、固相化抗体と競合してしまう可能性はあるわけですよね。現在もバックが高すぎるので見えていないだけで、実は競合が起きている可能性だってあるような気がします。 そういう意味では、標的蛋白と一次抗体を同時に、というのはかなり不安なのですが・・・ 二次抗体も、60000倍でもブランク0.1なのですか。やはり高いですね。 検量線がきちんと出る限り、どれだけ希釈しても良いとは思いますが、やはりそれだけ希釈しないとバックが下がらない系というのは、どこかに根本的な問題がある、ということでしょう。 やはり標識一次抗体に期待、でしょうかね。
>一次抗体に標識化されてある抗体が無いためです。 なるほど。まあ普通はありませんよね。 外注でも標識抗体は作れますし、最終的には一次抗体を標識化した方が安定した成績が得られるようになるでしょうね。 今の状況でブランクが高くなる理由は、二次抗体が目的の一次抗体ただけでなく固相化抗体と反応してしまっているという可能性が高いように思えます。マウスとウサギということで、同じ齧歯類だし。 固相化抗体と一次抗体は自作で二次抗体は市販のものを使われているのだろうな、と思うのですが、この二次抗体はモノクロなのでしょうか。ポリクロだと固相化抗体の方に反応してしまうことも十分あり得そうなことのように思えたりもします。 サンドイッチ法の場合、固相化抗体の認識部位と標識抗体(この場合一次抗体ですが)の認識部位が位置的に近いとあまりうまく反応しないことが多い、という話も聞きます。つまり両方の抗体をモノクロで作らざるを得ず、けっこう高い精度が求められると思うのですが、その辺の話はブランクの問題が解決してからなのでしょうね。 また、標識抗体の濃度もけっこうＯＤ値を左右するファクターだと聞きますし、場合によってはやはりブランクで0.3くらい出てしまいます。 それも「手洗いだと良いのだけど、プレートウォッシャーでやるとバックが高くなる」とかいう場合もあったりして、開発中の環境では気づかなかったことがフィールドで判ってしまう、ということも多々あるようです。 なので、それこそ１つ１つ潰していくしかないのでしょう。 ということで、私なら一次抗体の標識化と同時に、現在の二次標識抗体の濃度を変えて試してみます。現状ならとりあえず"薄くする"方向でしょうか。 それと洗浄は手洗いで４回を標準としてみます。 市販されているようなエライザキットでも、ウォッシャーを使うと手洗いよりバックが高く出ることがある、というのはよく経験しています。十分習熟すれば手洗いの方がデータのブレが少ないのは確かです。
補足
丁寧でわかりやすい回答ありがとうございます。とても参考になります。 指摘どおり、二次抗体は市販のポリクロです。やはり齧歯類同士など近いところでは反応してしまうことはあるみたいですね… 固相化抗体はモノクロ抗体を使用して、一次抗体ではポリクロ抗体を使用しているので、一概には言えませんが、違う認識部位を認識していると思います。 洗浄は手洗いでTBS-Tで6回行っています。 二次抗体の量は、抗体の付属プロトコルには7500～30000倍希釈で使用 と書かれているのですが30000倍で使用するとブランク値が0.3になり、 60000倍希釈で使用するとブランク値は0.1となりました。 プロトコルに書かれている希釈倍率より希釈しても検量線が書ければ大丈夫なんでしょうか？
もう年末休みに入っちゃってるでしょうけど・・・ >固相化抗体と一次抗体、二次抗体を加えた値が0.3と高く、 >固相化抗体と二次抗体だけを加えた値も0.2となりました。 >固相化しないで一次抗体と二次抗体を加えた値は0.02 この結果からは二次抗体と固相化抗体が反応しているような感じですね。 そもそも読み返していて疑問に思ったのですが、このELISAの系は １．標的蛋白をマウスで免疫した抗体をプレートに固相化 ２．固相化プレートに検体(標的蛋白)を入れる ３．洗浄後、一次抗体を入れる (標的蛋白を？？で免疫した抗体) ４．洗浄後、二次抗体を入れる (？？をウサギで免疫した抗体) ５．発色基質液を入れる ６．反応停止液を入れてリード ということになるのですよね？つまり酵素標識抗体は二次抗体と。 なぜ抗体を２つも使う系にしたのでしょう？ 普通は固相化抗体と標識抗体だけで系が成立すると思うのですが、何か特別な理由があるのでしょうか。 一次抗体をどの動物で作っているのかの記述がありませんが、もしマウスだったりすると固相化抗体と二次抗体が反応するのは当たり前、ということになってしまいます。
補足
回答ありがとうございます。いろいろと説明不足ですいませんでした。 １．標的蛋白をマウスで免疫した抗体をプレートに固相化 ２．固相化プレートに検体(標的蛋白)＆一次抗体を入れる (標的蛋白をウサギで免疫した抗体) ４．洗浄後、二次抗体を入れる (ウサギをヤギで免疫した抗体) ５．発色基質液を入れる ６．反応停止液を入れてリード このような手順で行っています。 ２.の段階で標的蛋白と一次抗体を一緒に入れています。別に加えても、一度に加えても結果に影響がなかったので時間短縮のためです。 >普通は固相化抗体と標識抗体だけで系が成立すると思うのですが、何か特別な理由があるのでしょうか。 一次抗体に標識化されてある抗体が無いためです。 抗体を標識化するキットなどもあり、一次抗体を標識化することも考えています。
まず最初にすみません。質問の数値を読み違えてました。0.3は一般的に言って高いです。普通は0.03～0.05くらいなのが普通でしょう。１ケタ見間違えてました。 ブランクという言葉の使い方はそれで合っていると思います。 すなわち、リーダーで読んだ後で、全ウェルのOD値からブランクのOD値を引いて計算するわけですよね。 つまり、固相化も何もしていないウェルに水だけを入れた状態で読んでみて、実際のブランクのウェルのOD値と大差なければブランクのOD値は適正、と判断できるわけでしょ。 水を入れたウェルでも0.01～0.02くらいは出ると思います。 ブランクが高くなる理由はそれこそ単純な操作ミスから予期しない抗体反応まで千差万別だと思います。 ご自分で考える方が力になると思うし、また実際の系の概要も知らない状態で適切なアドバイスができるとも思えないのですが、考えられる要素を１つずつ確認していくしかないでしょう。 固相化抗体と一次または二次抗体が反応している場合、クロスとは言わない気がするのですが、そこを疑っているのなら確認は比較的容易です。落ち着いて考えて確認してください。
補足
丁寧な回答ありがとうございます。 確かに原因は、抗体の濃度、洗浄などいろいろ考えられると思います。 固相化抗体との反応を確認するために、 固相化抗体と一次抗体、二次抗体を加えた値が0.3と高く、 固相化抗体と二次抗体だけを加えた値も0.2となりました。 固相化しないで一次抗体と二次抗体を加えた値は0.02 と一般的なブランクの値となりました。 このような確認の仕方であっているかわかりませんが・・・ もし固相化抗体と一次抗体もしくは二次抗体が反応しているのであれば このようなことは良くあるのでしょうか？ 何度も書き込んでしまいすいません、もし御意見等がありましたらお願いします。
ぜんぜん普通ですよ。0.04～0.05くらいまでは普通に出ます。 ブランクの吸光度の確認くらいでしたら、固相化する前の新品プレートに水でも入れて読ませてみると簡単にできますよね。一度試してみて納得していただければ良いと思います。 ちょっと厳しい言い方をすれば、この程度のことならちょっと考えれば確かめる方法は思いつくはずです。 もうちょっと厳しい言い方をすれば、この程度のことを自分で考えることができない人が「新しい系の確立」という仕事ができるとは思えません。 質問者さんは学生さんだろうと決めてかかってますが、研究開発に限らず、どんな仕事でも自分で考えて解決法を捻り出すということはとても大切です。研究開発はそれが全てといって良いくらいです。 大学とはその訓練をするところ、と私は思っています。自分の知識や施設や検体だけでは足りなければ、どこをどう調べれば答えが見えるのか、といったことも含めてですね。 とはいうものの、人に聞いて恥をかけるのも学生のうちくらいですから、かくべき恥は恐れずにかくべきだとも思います。 なんにせよ、頑張って下さい。
補足
回答ありがとうございます。確かに自分自身で考える事もとても大切だと私も思います。 すいません、もしかしたらブランクという言葉を私が間違えて使っているのかもしれません。 固相化、ブロッキングを行いSampleの代わりにPBSを加え、 検出抗体、二次抗体、発色液を加えたwellの値のことを言いました。 つまり抗原が入っていないwellの値が0.300くらいになってしまいます。 もしこの値が高いとしたら、固相化抗体と一次抗体または、 二次抗体がクロス反応しているということもありえるのでしょうか？？ 固相化抗体はmouseで二次抗体はRabbitを使用しているのですが…
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