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制限酵素SmaIによるプラスミド切断について
TOYOBOさんのSmaIと付属の専用バッファーを用いて、大腸菌DH5αで増やしたプラスミドを切断しようとしているのですが、なかなか切れません。 大腸菌内ではSmaI認識配列はメチル化されにくいとは思うんですが、どうなんでしょうか？ 単に活性が低いから反応時間が足りないだけなんでしょうか？
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- MIYD
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本当にメチル化が原因だと考えているのならば、 XmaIで切ってみてはいかがでしょうか。 SmaIと同じ認識配列で,メチル化の影響を受けません。 切る目的が分かりませんが、 サブクローニングであれば、XmaIは突出末端なので悪くはないと思います
お礼
ありがとうございます、もしまだ上手くいかないなら、Xma1試してみたいと思います。
- MIYD
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実験のコントロールに何をしていますか？ 汚いプラスミドはどの酵素でも切れません 失活した酵素には活性はありません 1切りたいプラスミドが別の酵素では切れるか 2使用しているSmaIは他のプラスミドを切断出来るか 3隣のラボから借りたSmaIは切りたいプラスミドを切れるか を確認してみてはいかがでしょうか
お礼
ありがとうございます。 Sma1は酵素もバッファーも注文したての新品で、プラスミドはSal1で切断後PCIとエタ沈したものを使っています。 Sma1はメチル化で切断が阻害されると書いてあったのですが、大腸菌で増やしたプラスミドは大丈夫だと思ったんですが、どうなんでしょう？ http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.asp?unitid=U100002660 とりあえず、プラスミドをCIA、エタ沈してもういちどやってみたいと思います。
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