シークエンス反応に使うプラスミドDNAを抽出したのですが、反応が十分に行かないのか、塩基配列をあまり読むことができません。サンプルのプラスミドDNAの純度に問題があるような気がするのですが、純度がよいDNAを抽出する方法を(経験)コツなどを含めてご教授願えますでしょうか。
プラスミドDNAは大腸菌から抽出します。シークエンス反応はサイクルシークエンス法です。泳動はアクリルアミドゲルで行っております。
投稿日時 - 2005-05-18 21:01:03
No.7です。遅れて申し訳ありません。
まずCIAはクロロホルム：イソアミルアルコールです。DNAの場合は24：1で混合ですね。
プラスミド抽出に関して、簡単な工程は以下の通りです。
(1)菌体をSol.1に再懸濁させ、RNaseを加える。
(2)Sol.2を加える。
(3)溶液が透明になったら（たぶん10秒くらい）ただちにSol.3を加える。
(4)15分程度放置。
(5)PCIを溶液と等量入れ、ボルテックス、遠心。
(6)上清を回収し、CIAを等量入れ、ボルテックス、遠心。
(7)上清を回収し、2-プロパノールを等量入れ、ボルテックス、15分間放置後遠心。
(8)上清を捨て、ペレットに70％EtOHを加え、遠心。
(9)上清を捨て、ペレットを風乾、TEや超純水に溶かす。
です。なお以上の方法はすべて常温で行ってください。溶液も冷やしたりしないでください。
投稿日時 - 2005-06-01 17:29:04
補足
(4)(5)の間に、遠心・上清を回収という工程をいれてもよろしいでしょうか？
投稿日時 - 2005-06-06 10:24:16
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ベストアンサー以外の回答（10件中 1～5件目)
私の場合はLB+Amp（終濃度100μg/ml）=3mlを処理しています。系は以下の通りです。
(1)菌体をSol.1（100μl）に再懸濁させ、RNase（10μg）を加える。
(2)Sol.2（200μl）を加える。
(3)溶液が透明になったら（たぶん10秒くらい）ただちにSol.3（150μl）を加える。
(4)15分程度放置。
(5)PCIを溶液と等量（500μl）入れ、ボルテックス、遠心（15000rpm、15min、RT）。
(6)上清を回収し、CIAを等量入れ、ボルテックス、遠心（15000rpm、5min、RT）。
(7)上清を回収し、2-プロパノールを等量入れ、ボルテックス、15分間放置後遠心（15000rpm、15min、RT）。
(8)上清を捨て、ペレットに70％EtOH（1ml）を加え、遠心（15000rpm、5min、RT）。
(9)上清を捨て、ペレットを風乾、TEや超純水（任意の量）に溶かす。
です。RNAが十分に除去されていないとのことでしたが、どのくらいの長さのものが除去できていないのでしょうか？もし50bp以下であれば塩に酢酸アンモニウムなどを用いて再度エタ沈を行うといいみたいです。100bp以上であればRNaseに問題があるはずです。また2-プロパノールの量が多くなっていたり、遠心の温度が低くなっていたり、フェノールのpHが変化していたりしないかチェックして見てください。
投稿日時 - 2005-06-20 16:12:51
お礼
RNaseの濃度が低すぎたのと、処理の時間が不十分だったみたいです。ありがとうございます。
投稿日時 - 2005-06-21 20:08:24
No.9です。
経験的意見としては入れないほうがいいと思います。チューブの壁にタンパクのつぶつぶがくっついてしまってうまく上清を回収できないからです。PCIを加えてボルテックスして遠心するときれいに3層に分かれますね。
投稿日時 - 2005-06-06 14:24:06
補足
きれいに３層にわかれました。教えていただいたとおりの操作(No.8)を、ひと通りDNA抽出操作を最後まで行い、電気泳動で確認してみましたところ、RNAが十分に除去できていませんでした。度々すみませんが、系も併せて教えていただけませんでしょうか？培養は私の場合、TB+アンピシリン1.5mlにて一晩です。
投稿日時 - 2005-06-11 11:57:25
お礼
なるほど、わかりました。ありがとうございました＾＾。
投稿日時 - 2005-06-08 16:39:35
＞私が読もうとしている配列はGC含量が高いです。
そうであればウレア（尿素）含量の高い変性ゲルの使用をお勧めします。
また、それとは別にゲルはそのままで泳動温度を上げたものも試す価値があると思います。
ただし、どちらも機械が対応していればの話です。
ちなみに私はGC含量70％位のものを読んでいました。
部分的には100％GCのみのものです。
GC100%のところは100ベース位だったと思いますがそこを正確に読むのに（2種のシークエンサーで試行錯誤して）3ヶ月位かかりました。全体では4ヶ月ちょっとでしたのでほとんどの時間をそこに・・・
両側から何度も読んで頑張ってください。
投稿日時 - 2005-05-25 22:09:52
お礼
はい、がんばります＾＾；。ありがとうございました。
投稿日時 - 2005-06-06 10:23:28
No.4です。
経験的なことで申し訳ないのですが、最新のキャピラリーを使ったタイプではRNAの混入はそれほど結果に影響を与えないのですが、アクリルアミドゲルの場合はRNAの混入がかなり影響しました。おそらくゲルだけでなくサイクルシークエンスに用いる試薬なども関係しているのいるのだと思います。
RNase処理に関してなのですが、私の研究室ではPCI→CIA→エタ沈という工程で精製しています。ちなみに抽出後にRNase処理を行わず、抽出とRNase処理を同時に行っています。市販されているほとんどのキットはこのタイプになっているのですが、菌体を再懸濁させる溶液にRNaseを加えておきます。そしてアルカリ→中和を常温、短時間で行い、その後30分くらい常温に置いた後、PCI→...と処理してプラスミドを得ています。
投稿日時 - 2005-05-22 13:11:53
補足
抽出とRNase処理を同時に行うということですが、詳しく教えていただけないでしょうか。
PCIはフェノール・クロロホルム・イソアミルの略ですよね。CIAは何の略なのでしょうか。
投稿日時 - 2005-05-25 14:43:37
どうも、必ずしもプラスミドの精製度が問題とは限らないような気がします。しかし、それを疑うなら、キアゲンのような、定評のあるシステムで精製してみて、改善が見られるかどうかためしてみるのがいいでしょう。プラスミド精製専用のでなくてもいいです。普段の方法で精製したものを、QIAquick mini columnにでもかけたらいいでしょう。QIAquick mini columnは安価ですし、バッファーをかえるだけで、PCR産物の精製や、ゲルからの精製などにも使えますので、無駄な出費にはならないでしょう。
いくつか、補足を、
PEG/NaCl沈殿は、RNaseでオリゴ化したRNAが、プライマーとしてはたらき偽のバンドが生じるなど、バックグラウンドが高くなるのを防ぐのが目的です。シークエンス反応をklenowを使って37Cでやるような場合は必須でしたが、耐熱性ポリメラーゼで高温反応させるのが普通になった今では、やらなくても大丈夫みたいです。
↓ご参考まで
http://oshiete1.goo.ne.jp/kotaeru.php3?q=1383427
シークエンス反応後のエタ沈は、フリーの蛍光ラベルヌクレオチドを除くのが目的で、ABIのシステムでは必須です。フリーの蛍光が短鎖側にかぶったり、ゲルに吸着して、バックがあがってしまうからです。
いずれにせよ、バックグラウンドが問題ではないようですから、これらが関係しているとは考えにくいです。
ひょっとして、テンプレート過剰で、一気にプライマーを使い切ってしまっているとか（これだと、短鎖側のシグナルはめちゃくちゃ強くなりますが、ある程度以上の長さになると、ぱったりと言うパターンです）
投稿日時 - 2005-05-20 11:37:27
補足
アルカリ法でプラスミド抽出をした後のサンプルと、さらにPCRの際に余分なprimerやdNTPを除くようなスピンカラムで精製したサンプルを使って、シークエンス分析してみましたところ、条件は全く同じでやったのにもかかわらず、後者の方は全く読めませんでした。純度を上げようとしたのが裏目に出たのでしょうか
。少し混乱しております。
投稿日時 - 2005-05-25 14:30:25
