- 締切済み
ベクター作製のためのPCRについて
生物学はほとんど学んだ事がない超初心者です。 先日、とある実験でベクター作製に携わることになってしまいました。 そのために勉強して来いといわれ、以下の様な事を調べなければいけなくなりました。 大腸菌で下の様なアミノ酸配列とDNA配列を持つ蛋白質を生産したいのです。 使用するベクターはpET3dというNovagen社のベクターだそうです。 そして、そのベクターに目的の遺伝子をNcoIサイトとXbaIサイトで挿入し、発現させたいのですが、どのようなプライマーを使ってPCRし、DNAを挿入すればよいのでしょうか。 目的蛋白質A: MCVTQYQKESQAYYDGRRSSSTVLFSSPPVILLISFLIFLIVG DNA配列: ATGTGCGTCA CCCAGTACCA GAAGGAGTCC CAGGCCTATT ACGACGGGAG AAGATCCAGC AGCACCGTGC TTTTCTCCTC CCCTCCTGTC ATCCTCCTCA TCTCCTTCCT CATCTTCCTG ATCGTGGGAT GA 私はDNA配列さえまともにわからない人間なので、質問の意味もちんぷんかんぷんで本当に困っています。 どなたか詳しい方、どうか助けてください。 よろしくお願い致します。
- みんなの回答 (2)
- 専門家の回答
関連するQ&A
- インサートDNAにNdeIサイトがある場合
大腸菌でタンパク質を発現させるため、pET21aをテンプレートに発現ベクターを作製します。 その際、NdeI/BamIサイトに目的遺伝子を導入しようと考えていたのですが、インサートDNAのど真ん中にNdeIサイトがありました。 Promoterおよびrbsと開始コドンの距離は重要であると考えられるため、 1. NdeI以外の制限酵素サイトに目的遺伝子を導入 2. Inverse PCRにより開始コドンの位置を調整 といった手法で発現ベクターを作製しようと考えているのですが、この方法に問題はあるでしょうか? また他に簡便な方法などはあるのでしょうか?
- 締切済み
- 生物学
- 遺伝子の化学合成法について
はじめまして。生化学の研究室に所属している学生です。 自分の研究で、目的タンパク質をコードする遺伝子を化学合成によって取得し、発現ベクターに挿入した後、大腸菌等でタンパク質を発現したいと考えています。 方法として、目的タンパク質をコードするDNAを、いくつかのオリゴヌクレオチド断片として合成し、DNAポリメラーゼを用いてPCRによって構築するという概略は知っているのですが、詳細な方法が分りません。この方法が載っている文献(論文、参考書など)を知っておられましたら、教えてください。よろしくお願いいたします。
- 締切済み
- 生物学
- 定量PCRのスタンダード作製
最近、リアルタイムPCRで増幅産物の定量を行うようになったのですが、 市販されているプライマーとスタンダードのセットでしか測定をしたことがありません。 自身でデザインしたプライマーで増幅した産物の定量を行いたい場合、 スタンダードはどのように作製したら良いのでしょうか? PCRの増幅産物をプラスミドにクローニングしてスタンダードを作製するようなことを読んだのですが、悲しいことに理解できずにおります。 また、塩基配列が判明している変異遺伝子やウイルス検出にあたり、手元に陽性コントロールとなるサンプルがないとスタンダードを作ることは無理でしょうか? 具体的な解説、初心者向けのおすすめ書籍・webサイト等がありましたら、教えてもらえないでしょうか。
- ベストアンサー
- 生物学
- コロニーPCRは問題なくかかる理由について
現在学部4年の学生です。 素朴な疑問なのですが、調べても出てこないのでこちらで質問させていただきます。 通常のPCRで裸のDNA断片に対してプライマーが結合してPCRがかかるのは理解できるのですが、コロニーPCRはなぜ大丈夫なのでしょうか? 私の考えでは、90℃の高温にしたときに菌が破裂するなどして死んでしまうから、DNAが溶液中に出てくるからかな?と思うのですが、これであっているのか不安です。 菌の細胞膜はプライマーが目的配列に結合するのに邪魔にならないのでしょうか。 菌の細胞膜には孔や色々な膜タンパク質があるから、たしかにDNAが全く通れないということはないと思うのですが。 急ぎの質問ではないのですが、前から気になっていて後輩にも質問されたので、どなたかお答えいただけると嬉しいです! 「自分はこう思う」とかでも大歓迎なので、宜しくお願いいたします。
- 締切済み
- 生物学
- PCR
2本のプライマーで目的遺伝子をPCRしました. その後,得られたPCR産物のsequenceを確認したら,2本のプライマー間のsequenceには変異や塩基の欠落等はなかったのですが,それぞれのプライマーの部分に塩基の欠落がかなり見られました. プライマー間に変異があったとしたなら,間違って塩基を取り込んでしまったのだろうと考えられるのですが,プライマーの部分は購入したまんまの状態なので,業者のプライマー合成ミスということなのでしょうか? 当然プライマーの部分のsequenceがあっているものもありましたので,恐らく購入したプライマーは目的の1種類の配列だけではなくて,間違った配列のものも含まれていると考えられるのでしょうか? または違った理由で,この様なことが起こるのでしょうか?
- ベストアンサー
- 生物学
- フレームをあわせるということ(組み換え蛋白の作製)
大変初歩的な質問なのですが、3つずつ蛋白を読むように発現ベクターを選ぶというのはわかるのですが、インサートに用いる遺伝子でORF以前の塩基は少ない方がよいのでしょうか?PCRで増幅させたDNAを制限酵素処理→TAクローニングでライゲーションさせています。 ORF手前20塩基ほどついています。 GST融合蛋白として発現させているのですが、GSTのみが発現していました。
- ベストアンサー
- 生物学
- 変異体構築PCRについて
pET11aベクターにキチナーゼの配列がインサートされているものを鋳型として、1ヶ所だけアミノ酸を変えた変異体構築を試みています。polymeraseはPfuUltra High-Fidelity DNA polymeraseを使用しています。しかし、プロトコールを元に反応系とサイクルを変えてPCRをかけていますが、電気泳動で確認してもバンドがでません。 構築できないと先に進まないため、困っています。 アドバイスお願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
- DNA配列決定とPCRの関係
未知の配列を調べる(決定する)ために 抽出したDNAの量が少ない場合は PCRが必要ですが、 未知の配列なのでprimer配列も決めることが出来ず、 primer配列を決めることができぬならば 増幅したDNAを使った配列決定も出来ぬという話になります。 結局、PCRが不必要なほどのDNA量が抽出で得られぬならば 未知の配列を調べることもできぬ。 この理解には根本的な誤解が有りますか。 DNAをいじったことが無いので易しい解説をお願いします。
- 締切済み
- 生物学
お礼
ありがとうございます。 遺伝子工学から勉強して一つ一つの語彙を理解するところから始めたいと思います。