形質転換効率について

質問

普通のｐBベクターをコンピテントセルに取り込ませ、L-Ampプレート上に植菌したもの（A)と、XhoIで処理した16ｓｒRNA（PCR増幅分）を挿入した組み換えｐBベクターをコンピテントセルに取り込ませ、L-Amp・IPTG・X-galプレート上に植菌しました。
形質転換効率が低下する理由はなんなんでしょうか？

回答No.2

euphrosyne · ベストアンサー

つまり
Ａ：空ベクター
Ｂ：インサート入りベクター
ですよね。

MIYDさんの補足みたいになりますが(しかも勝手に)
コロニー総数の話から。

・ライゲーション効率
配列を挿入する際にベクターとインサートを一つの制限酵素で切断しましたよね？ライゲーションでこれをそれぞれくっつけるわけですが、ここで
１：くっついてないやつ
２：ベクターがそのまま元の形に戻ったやつ
３：インサートが入ってくっついたやつ
が生じます。

１の場合取り込まれません。分解されます。この分のコロニー数が減ります。
因みに２の場合、カラーセレクションにおいては青コロニーです。ハズレ。で、３が成功ですね。白コロニー。

ここにおいて実は形質転換効率とコロニー形成数はイコールではありませんが、それは最後に。

・大きくなるって
ベクターの一箇所を切断して、そこに配列を挿入しましたよね？５両編成の列車の三つ目と四つ目の間に貨物列車を入れたら、列車全体でみたら長くなりますね？塩基が長くなること＝サイズが大きくなると考えてください。ベクターのようなプラスミドだと、塩基が長くなるほど円周が大きくなって、円が大きくなりますね。

・大きさ
プラスミドＤＮＡ濃度を何で測ってるか分かりませんが、分光光度計で測ると3kbpと7kbpのプラスミドは同じ数存在しても、濃度は7kbpの方が多く計測されます。よって同じgで揃えても、プラスミド数は異なります。で、最初と同じ理由。取り込める状態のベクター数が少ない。
また、小さいプラスミドの方が大腸菌は取り込みやすいです。大腸菌の菌株との相性もあります。

最後に、形質転換効率とは、通常、同濃度の同じプラスミドの取り込み能(コンピテンシー)を異なる大腸菌(コンピテントセル)間で比較するものであって、プラスミド間で比較するものではありません。
ぶっちゃけると同じ用に作って分注した大腸菌なら形質転換効率は「同じ」です。今回は他の条件が変わったのでした。

こんなかんじで。

回答No.1

MIYD

何と何を比較して効率が低下しているのか質問文だけでは分かりませんが、

多分、
ライゲーション効率が100%ではない
ベクターのサイズが大きくなるとcfu/ug DNAなので、モル数は低下する
ベクターのサイズが大きくなると入り難くなる
といった回答を求めているのではないですか？

補足

（A)のプレート上に存在するコロニー総数と（B)のプレート上に存在するコロニー総数の違いが何の理由で起きているかを知りたいんです。

またベクターのサイズが大きくなるとはどういうことでしょうか？