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シークエンス

今TOPO Cloning kitを使ってシーケンスを行っています。ベクターにM13 primerとT7&T3 primerのサイトがあるのですがどちらもうまくPCRが進みません。M13やT7primerが結合しないことはあるのでしょうか?

みんなの回答

  • tomoyaok
  • ベストアンサー率40% (79/195)
回答No.3

No1です。 No2さんの意見に補足です。 ユニバーサルなプライマーは多少配列が異なっていても 反応が進むか進まないかについては基本的に大丈夫です。 確かにM13といっても配列・長さをどこからとるかによって 異なるのですが、それくらいの違いで質問者の内容の シーケンスが読めなくなることは滅多にないでしょう。

garunia
質問者

補足

ご指摘ありがとうございます。使用しているprimerの配列ですが、これはkit内にあるものと同じ配列であることを確認しています。またコントロールもpUC18とそれに結合するprimerで行っています。ですがコントロールのほうもきれいに読めていません。

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  • Dr_Hyper
  • ベストアンサー率41% (2482/6031)
回答No.2

primerのsequenceは手に入りますか? TOPO Cloning kitのベクター配列を存じ上げませんので確かなことは言えませんが、3’末端が変わっている場合があることをふと思い出しました。 オリジナルのM13やT7の配列を使ってあればいいですが、違ったキットに入っていたものを併用したら名前は同じでも微妙に違うものを使っていたということがあります。ただ、どちらともになるとかなり他の要因が考えられますので、他のかたの回答にもコントロール実験はうまくいっているのか?との書き込みが多くなると思います。

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  • tomoyaok
  • ベストアンサー率40% (79/195)
回答No.1

コントロール実験をしましょう。 テンプレートを自分のプラスミドでなくキットに付属のPUC19(だったよね)を使用して下さい。 それでうまくいくようであれば、プライマー設計に頭を使って下さい。 ほとんどの場合、そのコントロール実験でさえうまくいかないでしょう。 エタ沈がヘタな場合がおおいです。チューブの壁についた塩をきっちり落とすように壁をこすりながら70%エタを入れる、この助言で助かった例をたくさん知ってます。 また、ハーフスケールでやっている場合、反応後にDDWでスケールを戻してやることもやる方がいいですね。

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