セリン／スレオニンキナーゼのKm,Kd値

質問

あるセリン／スレオニンキナーゼのKm,Kd値を出したいのですが、実際どのような実験を組み立てればよいかわかりません。（教科書を読んで式の出し方とかはわかるのですが、、、）　どなたか教えて下さい！！

回答No.2

gori8063

反応速度は「ある条件下で、単位時間当たりどれだけの分子数が分解されるか」で定義されます。

「ある条件下」はあなたが設定して構いません。
一般的には

活性の定義：下記の条件で、1分間に1 μmolのXXX（生成物）を遊離する酵素活性を1 Uとする。

ということが多いですね。

今回は基質濃度を振る実験ですから、生成物の定量を行って速度を出すのが常道かと思います。

タンパク濃度はあなたが測定しやすい濃度で用いればよろしいかと思います。ただし、その濃度などは「条件」として示す必要はありますが。酵素濃度は直接的にKm値には関与しませんが、下記URLに示すように「タンパク質1mgあたりの酵素活性　＝比活性」として表記することがあります。

参考URL：

http://www.kochi-u.ac.jp/~tatataa/tech2/protein/reaction.html

補足

お返事ありがとうございました。

今回はリン酸化酵素なのですが、その場合
速度は、どのくらいのATPを分解するかを
測ればよいのでしょうか。もしくは、
何molのATPを基質に取り込んだか、を
調べればよいのでしょうか。

もしリン酸化酵素のKm,Kdを測っているような
論文をご存知でしたら、教えていただけますか。
質問ばかりになってしまいすいません。

回答No.1

gori8063

まずは酵素活性の測定（アッセイ）法が確立されているかどうかです。これがなければ話になりません。

キナーゼでしょうから、生成物のリン酸化タンパク質（か、一緒に出てくるリン酸など）の定量が必要になるかと思いますが、その系はお持ちですか？

それがあるのであれば、あとは基質濃度を変化させて教科書どおりにプロットすればいいだけです。

おそらくアッセイ系を組むのがかなり大変だとは推測しますが。

補足

gori8063さん、早速の回答どうもありがとうどざいました。

アッセイ系(in vitro kinase assay)は確立されています。キナーゼは免疫精製物、基質はGSTペプチドです。基質を振るのはわかるのですが、その時の酵素量をどのくらいにするのか、またその時の速度(v)をどのように求めたらよいのか（取り込みATP量を量る？　それをtime, kinase量、基質量で割る？）がよくわかりません。

一応生化学の教科書を何冊か見たのですが、もし細かいやり方を書いている教科書かなにかありましたら、教えていただけるとありがたいです。