- 締切済み
免疫染色の2次抗体について
Donkey anti-Goat IgG, biotin-SP conjugate, Species Adsorbed: H, M, R, Ch, Gp, Eq, Ht, Rb という2次抗体について教えてください。 現在、上記の抗体をGoat1次抗体に対して使用していますが、Species Adsorbed: H, M, R, Ch, Gp, Eq, Ht, Rb ということはマウスの1次抗体にも吸着してしまうということなのでしょうか？ 今後、マウス1次抗体を使用するため、2次抗体を別に購入しようと考えているときにもしかして、、と思いまして。。 また、HRP conjugateとBiotin conjugateは使い分けをどのようにしたらよろしいでしょうか？ABC法で増感するのにあたりちょっと悩んでおります。 よろしくお願いいたします。
- nanaseGLAY
- お礼率50% (1/2)
- 生物学
- 回答数1
- ありがとう数0
- みんなの回答 （1）
- 専門家の回答
みんなの回答
- Mr_Spock
- ベストアンサー率75% (57/76)
Species Adsorbedというのは、どの生物種のIgGで吸収処理をしたか、ということです。他種への交叉性を排除しGoat IgGにたいする特異性を高めるために、リストアップされている種のIgと混ぜて、それらと反応する抗体を吸収して除去してありますよということです。Goat IgGで免疫しても、他の種のIgに交叉する抗体ができてしまいます。交叉する抗体が存在すると、一次抗体の由来生物を変えて二重染色するのが困難になったり、たとえばマウスの免疫組織染色をした時に、内在性のマウスのIgと反応して一次抗体の局在とは無関係な染色がおこったりします。 >HRP conjugateとBiotin conjugateは使い分けをどのようにしたらよろしいでしょうか？ABC法で増感するのにあたりちょっと悩んでおります。 ABCを使うと決めているなら、悩むことはないのでは。一般論で言うと、反応が多段階になるほど落とし穴も増えるので（たとえば内在性のピオチンとの反応が起こる可能性や、巨大なAB複合体が浸透性を下げ非特異的吸着を起こす可能性）、HRPラベルの二次抗体で検出できるものであれば、わざわざABCは使わないようにしたほうがいいと思います。
関連するQ&A
- 免疫染色の方法について（モノクローナル抗体の場合？）
マウスを用いて免疫系関連の研究をしている修士2年です。研究室3年目にして恥ずかしいのですが質問です。 現在、ある内分泌器官を、DABを用いた酵素抗体法（ABC法）で染めて、あるペプチドを産生している細胞の頻度及び分布を調べようと思っています。用意した物とプロトコルは以下です。 ・組織サンプル（ブアン固定→パラフィン包埋→4μm切片） ・Elite ABC kit（内容：Blocking用Goat血清、biotin結合2次抗体、ABC溶液） ・1次抗体（Rabbit anti-（そのペプチド）antibody） プロトコル・・・通常の脱パラ、浸水化、抗原賦活化（一応）、内因性ペロキシダーゼ除去→kitのプロトコル（1次抗体は4℃o/n） この1次抗体は、ある先生に紹介されて知り合った他大のA教授に分与していただいたものです。A教授とは直接お会いしたことはなく、メールや参考文献も自分の指導教官であるB教授を通して受け取っています。A教授はこの1次抗体を自分で作成（既知のアミノ酸配列からペプチドを合成→ウサギに投与→血清から精製）して、その抗体を用いた染色で論文を沢山出しているような方です。その論文を参考にして、今回のプロトコルを組んで染色してみたのですが、全然うまくいきません。組織内の細胞がところどころポツポツ染まるはずなのに、赤血球と血管内皮細胞以外の組織細胞全部がベッタリと染まってしまうのです。A教授の染色で私の染色と異なる点は、動物がラットであること（問題のペプチドは両種で保存されていることが分かっている）、kitを使っていないこと（ABC法ではなくPAP法、発色は同じくDAB）のみです。 こんなことはA教授に聞けばいいのですが、うちのB教授は少々プライドが高いところがあって難しそうなのです。それに、B教授はもともと免疫染色が得意ではないようです。B教授は今のベッタリ染色像が正しい染色像だと思っていて、このまま私の論文まで持っていくつもりみたいですが、色々な参考文献を見ている私としては、このベッタリ具合は絶対何かおかしいのです。（でもB教授は私の意見はお構いなしです(ノд・。) ）だって本当は、下垂体のACTH細胞くらいくっきり染め分けることが出来る抗体なんです。先入観を差し引いても、ラットとマウスでこんなに違うとは到底思えません。 さて、長々と読んでいただいてありがとうございます。。。質問は以下です。 1．私の染色方法やkitで、「もしかしてここのミスかも・・・」と気になる点があったら教えてください。（モノクローナル抗体を使った染色にはもともと不慣れです。） 2．指導教官であるB教授に「待った！」をかけるために、いい策はないでしょうか？？？（この質問に関してはカテ違いかもしれませんが・・・。）
- 締切済み
- 生物学
- 免疫染色について（抗体）
免疫染色に用いる抗体において同じ物質に用いるものでも、エピトープがC末端のものとN末端のものがありますが、どのように使い分ければいいのでしょうか？ペプチドの合成系を見たいのであればC末端のものを使用すればいいのでしょうか？抗体作成をしたりするラボではないため、そもそもポリクロでこのような違いがあることが充分に理解できておりません。初歩的なことかもしれませんがどなたか教えてください。
- ベストアンサー
- 生物学
- FACS用の抗体を免疫染色に使えませんか？
免疫染色をしている学生です。 論文に書いてあるクローンとおなじクローンで蛍光をラベルされたFCM用抗体が研究室にあります。能書にはFCM用onlyと書いてあるのですが、おなじクローンで免疫染色用の抗体が市販されているようです。FCMで使っている抗体を免疫染色で使えませんか？高価な抗体を買わなくても済むかもしれないと思い、質問させていただきました。使える場合、又は使用した経験のある方、希釈倍率はFCMと比較してどのように考えればよいでしょうか？ご教授お願いいたします。
- 締切済み
- 生物学
- 免疫染色時の1次抗体・２次抗体の濃度
免疫染色初心者です．よろしくお願いします． 血管内皮細胞，線維芽細胞，心筋細胞の特異的タンパクを染めるのに，Von Willbrand factor(rabbit),DDR2(rabbit),α-actinin，２次抗体としてgoat anti-rabbit IgG等の抗体を用います．こういう場合の１次・２次抗体の濃度はやはりある程度100倍，1000倍なり自分で希釈してみて決めるしかないのでしょうか？他の方の質問も拝見して，自分で調べるしかないのかなとは思いましたが，どの濃度で一番反応が出やすいというのはないのでしょうか．よろしくお願いいたします．
- ベストアンサー
- 生物学
- 免疫染色時の抗体の吸収について
免疫染色に用いる抗体を正常血清で吸収すると良いと言われますが、この際用いる血清は非働化が必要でしょうか？ 培養に用いる血清は必ず非働化していますが、免疫染色では不要にも思うのですが如何なものでしょう？ むしろ非働化しない血清を用いたほうが良いものなのでしょうか？ どなたかご教示ください。
- ベストアンサー
- 生物学
- 免疫染色 抗体の動物種・・・
こんにちは。よろしくお願いします。 免疫染色を行っています。 一次抗体、二次抗体をのせて、発色させて抗原の位置を観察する原理は分かるのですが、動物種をどうそろえるのかが、イマイチ分かりません・・・ 一次抗体と二次抗体の動物種を別にする理由はどうしてでしょうか？ また、ブロッキング剤は、全く関係ない動物種にすれば良いのでしょうか？ すみませんがよろしくお願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
補足
御丁寧な回答ありがとうございます。 吸収処理のことでしたか。。交差反応と混同していました。 ＞ABCを使うと決めているなら、悩むことはないのでは。 HRPについて充分に理解していないのかもしれませんが、ABCであればBiotin標識2次抗体を使用するものだと理解しています。しかし、結局最終的な発色はDAB－Peroxidaaseで行うので、HRP conjugateの位置づけをこれまた混同していました。HRPラベルのものは基本的に増感法を用いないときに使うと理解してよろしいのでしょうか？