GST結合タンパク質が精製できません

質問

GSTに結合した目的タンパク質が精製できずにいます。

具体的には、グルタチオンセファロースに結合させて、溶解した液をSDS-PAGEで電気泳動した際に、目的のバンドと同じくらいの濃さでで他のバンドが複数出てしまっています。

同じような経験をして、それを解決された方
もしくは、改善する知識をお持ちの方がいましたら教えていただけないでしょうか？

目的タンパク質は50kDaです。
大腸菌はBL21で, 培養は20℃でOD650=0.4にしてからIPTG 0.1mM加えて、20℃でオーバーナイトしています。
グルタチオンセファロースはGEヘルスケア製です。
カラムではなくバッチ法で精製しています。

どなたかよろしければ教えて下さい。

回答No.2

otx

（１）よくあることです。目的のタンパク質によっては違いがあります。
これはおそらく、プロモーターがどうとかいったことだ理由ではなく、
タンパク質が大腸菌に悪影響を及ぼし、タンパク質の発現が高いと生育に影響した結果として発現が弱い集団が増殖に有利であるから、相対的に発現が低く見える場合もあります。

解決策としては、タンパク質の全長を発現させなくても良いのであれば、サイトを変えてみるとかしてみると改善することがあります。
全長でつくらなければならない場合は、月並みな条件検討ですが、
「強い誘導（37℃で前培養後37℃で１時間誘導とか）で短時間」か「弱い誘導（温度を低く４～16℃とか）で長時間」
この二つをやってみるくらいしか、実際に自分でやっていないことにはアイデアが浮かびません。

あと、気をつけなかればならないのは、GSTはそうなりづらいですが、目的タンパク質が不可溶性になっている場合です。沈殿にくることがたまにあります。これもタンパク質次第です。対応策は上記と同じになるかと思いますが・・・。

（２）これはベクターを入れていない大腸菌にIPTGを加えたときにも見えるものなのでしょうか？それとも目的のベクターを入れたときだけの話でしょうか？
そもそも、精製していない大腸菌のタンパク質を泳動したときにもそのバンドは誘導されてくるのでしょうか？
大腸菌を何らかの方法で壊した後、遠心した上清を精製に用いると思いますが、沈殿を泳動してみましたでしょうか？

順番をバラバラに書きましたが、これらのことはチェックされましたか？
状況がいまいちわかりません。

あと、この手のタンパク質の精製方法とトラブルシューティングは、市販の実験書に事細かに書いてあります。羊土社や秀潤社等の書籍を参考にされることをお勧めします。

回答No.1

otx

はっきり言って、うまくいかないときの理由はいくらでもあります。
また、タンパク質はたとえGSTタグ付きであっても、タンパク質によって結構違いがあります。
対応策を書きだしたらここでは狭すぎるくらい、私は可能性を書くことができます。

まず、こちらのトラブルシューティングを確認されたらどうでしょうか？
http://www.gelifesciences.co.jp/tech_support/faq/chm/aff_fp.asp#ai

お礼

早速のご回答ありがとうございます。
最近このような実験を始めたばかりで、右も左もわからない状況ですので、
otxさんのような回答を頂けると非常に心強く感じます。

現在、(1)ベクターだけを大腸菌に入れた時に得られるタンパク質と、ベクターに目的タンパク質を組み込んだものの間で、同じプロモーターなのに発現量が大きく違っている。

(2)IPTGで誘導されたタンパク質以外のバンドが濃く出る。

の２点を主に解決したいと思っています。
(2)の方はゲル濾過をやってみるほうで検討をしています。
しかし、肝心の(1)の方はいろいろと考えてはいるのですが、初心者なものでベクターを変える位しか策が思いつかないのが現状です(培養温度、IPTG量はある程度検討しました)。
このままではゲル濾過しても、目的のタンパク質がわずかしか取れないのではないかと考えています。

何かアイディアがあれば教えていただけないでしょうか？