RNA抽出について

質問

私は長年タンパク質専門で研究を行ってきたため、分子生物学は学生時以来なので大変困っております。
ラットの凍結組織(肝臓)からRNA抽出を行いましたが、うまくいきません。とは言え、同時に10本行ったらうち4~5本はOK、4本行ったら2本OK、と言った具合でいくつかは成功します。
キットはQIAGENのRNeasyPlusを使用し、凍結組織20~30mgに対し抽出液を600μl入れてポリトロンでホモジナイズし、gDNA eliminatorカラムも使用しています。中に入っているプロトコル通りであることも確認しました。組織の保存状態は悪くないです。うんと古いというわけでもありません。
研究室の人間に聞いても満足な返事が返って来ないので、こちらで質問させていただきました。経験がある方、アドバイス宜しくお願い致します。

回答No.7

tatoo · ベストアンサー

質問者さんは組織の保存状態についてわざわざ言及されているので、
その点は問題ないとして書き込ませていただきます。

私の感覚ですが、RNA抽出の過程にはものすごく強いタンパク質変性剤を使用しますので、
そのタンパク質変性剤の存在下では、まずRNAが分解されることはありません。
しかし、最終的にはタンパク質変性剤が存在しない溶液にRNAは溶けている状態になるので、
そのときに、それまでに取り除けなかったRNaseの活性復活、
もしくはその最後の溶液にRNaseがコンタミしていると最悪の結果になります。

それで私だったらまず疑うのは、最終的に溶かす水です。
これには少量でもコンタミするとRNAは壊れてしまうと思います。
もしそれを確認するのであれば、既に抽出されたRNAを質問者さんが使っている水で溶かして37℃で30分くらいおいた後、
電気泳動するとわかると思います。
この方法で使われている試薬等をチェックすると犯人がわかるときがあります。
ですが、タンパク質変性剤に含まれている場合はわからないかもしれません。

次に疑うのは、組織の量です。
確かにキット等では上限が記されているとは思いますが、試薬に少量コンタミしたRNaseより、最も多くのRNaseは組織由来のものであると私は思います。
多すぎるRNaseは最終的に残る可能性を大きくしてしまうと思います。
ちょっと組織の量を控えめにしてみてはいかがでしょうか。

あと、質問者さんが取ったRNAを泳動した場合、失敗と思われるものは全く何も泳動していないように見えるのでしょうか？
それとも、これが分解産物だろうなぁというスメアっぽいのも見えないのでしょうか？
もし、スメアも何も見えないというのならば、抽出行程のかなり初期の段階で壊れているか、
単に回収がうまくいっていないためであると考えられます。

回収については実際見ていないので何ともいません。
しかし、初期の段階で分解されるというのならば、やはり試薬のRNaseのコンタミをチェックするのがはやいかもしれません。
RNAがとれたりとれなかったりするのは、RNaseのコンタミが、なんと言うか、
うまくいくかいかないかのギリギリのところをさまようようなコンタミ具合で、
うまい人はいけるけどそうでない人は時々壊れるといったことなのかもしれません。
後はもう１つは、うまくいっている人と質問者さんが同時に同じサンプルでやることですかねぇ・・・。

乱文にて失礼します。

お礼

お礼が遅くなり、皆様方には大変失礼いたしました。
ようやく解決しました。
とっても悩んでいろいろ皆様のアドバイスに従って考えておりましたが、つまらないことが原因でした。

ここのところ、しばらく来ていなかった人が、ガラス容器にチューブを入れてRNA実験台に置きオートクレーブを忘れ、前に使ったアルミホイルがかぶっていたため、私はオートクレーブしたものと勘違いして使用していたことが判明いたしました。やっと復帰してきたため判明いたしました。

ただ、私は遺伝子実験には大変不慣れなため、皆様のアドバイスでいろいろと勉強になりました。皆様、本当にありがとうございました。

補足

とても詳しくお答えいただきまして、ありがとうございます。
試薬に関しては、同じ試薬を使って培養細胞からRNA抽出を行ってみたところ、培養細胞は充分量、全てのサンプルで回収できていましたので、やはり組織由来の可能性が強いかな…と思いました。ます組織量を検討してみたいと思います。
電気泳動では、うっすらスメアに見えるような感じがしますが、はっきりとはしていません。うっすらしているということは、初期段階から壊れ始めているのかもしれませんね…
ちょっと見えて来た気がします。ありがとうございます。
お礼は改めて後日…ありがとうございました。