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分光光度計によるRNA濃度定量
RT-PCRをするためｔRNAを抽出してサンプルを作製し、そのRNA濃度定量のため分光光度計を使用しています。スペクトル計測していますが山のピークが260nmでなく270nmくらいになってしまいます。原因として何が考えられるのでしょうか。なおRNA抽出はTRIzolで租抽出し（3層分離まで）その水層をスピンカラムにとおしてtRNA抽出しています。
- johnjohnjohn
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- methyl
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最も簡易な方法としては核酸の純度は260/280の値で純度を推定します。これは、核酸(DNA,RNA)は260近辺に波長のピークがあるのに対し、タンパクは280寄りにピークがあることを利用しています。ピークが270近辺にあるというだけではタンパクのコンタミの可能性も考えられますが、ピークの形状（二山であるかなど）や260/280比(1.7未満ならタンパクコンタミかも)、あるいは260以下の波長(例えば260/230比など)もないとはっきりとは判断できません。純粋なオリゴで測定した場合の260/280は、DNAでは1.8くらい、RNAは2.0程度と言われていますが、実験的には1.7～2.1くらいなら問題ないと思われます。（ただ、吸光度のレベルでRNA,DNAを区別することは不可能ですが。。どうしても心配ならもう一度DNase処理をされるのをお薦めします）ただRNAの場合、重要なのは RNaseによって分解されていても吸光度はあまりかわらないので、泳動するなどして、分解が起こっていないことを確かめるのも重要です。
- sayasaya6655
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260nmくらいでピークがでるものってRNA・DNA・蛋白がありますよね。 トライゾルでの抽出は数回しかしていませんが、 DNAが混ざっていることは考えられませんか？ よく260/280nm比でRNA/DNAの純度が分かるといいますが、 これは測っていますか？ 素人みたいなアドバイスですみません。
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お礼
ご返答ありがとうございます。参考にさせていただきます。