cDNAライブラリー作成について ZAPベクター
- ZAPベクターを使用したcDNAライブラリー作成の際、パッケージング後にインサートを確認できるのか、またはライゲーション後に確認できるのかについて質問です。
- 電気泳動や吸光度測定によってベクターの長さからインサートを確認することができると聞きましたが、具体的にどの段階で行うのかや使用する条件について疑問があります。
- 情報が少なくわかりにくかったため、cDNAライブラリー作成を行いたい方から質問です。
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ｃDNAライブラリー作成について ZAPベクター
ZAPベクターを用いてライブラリーを作成していますが、in vitroパッケージング終了後の段階で、インサートを確認したりすることはできるのでしょうか・・・？もしくはその前の段階で、ベクターに連結（ライゲーション）した後などでは可能でしょうか？ 先日電気泳動をしたり、吸光度を測定することによってベクターの長さから換算してインサートの確認ができるというような事を聞いたのですが、どの段階から行うのか、泳動だったらアガロースでいいのか、何％なのかや、吸光度はDNAとして測定すればいいのかなど、いまいちよく理解ができませんでした。清書を見てもあまりそのような記載がないように思えるのですが、どなたかご存じの方がいらしたら教えて頂きたく質問しました。 どうぞよろしくお願いいたします。
- cyarubino
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- 生物学
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>その後にwhiteの部分をさらにスクリーニングを続け プラークのレプリカをとり、ハイブリでスクリーニングし、当たりをピックアップしたのに 確認PCRでネガティブ（インサートが入っていなかった）という事ですか？ クローニングなんてそんなものですよ あきらめずに何度もチャレンジすることです。（もちろん各工程はポジコンなどできちんとチェックしてますよね？） ＞ベクターの長さがだいたい600ｂｐ位 そんなに小さいベクターがあるんですか？
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- ebikichi
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追加です 作成したライブラリーを制限酵素で切って泳動ってことも考えられますが、ブロードになるでしょうね
- ebikichi
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私自身やったことがないので、、、、（隣で見てはいましたが） ZAPベクターの場合 あまりインサートの確認はしないのではないでしょうか？ 予想されるインサートの長さはどれくらいですか？ ファージミドの長さはどれくらいですか？ 泳動で差は出るにしても インサートの長さまで示唆できるでしょうか？（吸光度も同じです） 一番大事なのはRNAの質 second strand cDNAの質です インサートの平均長が知りたい場合はsecond strand cDNAを定量すべきです（この場合量が少ないのでアイソトープを使うと思います） ライゲーション効率を知りたい場合はb-galでＢ／Ｗができるはずです いささかの自信もありませんが、お答えがないようでしたので回答したしました 失礼いたしました
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お礼
早速のご返答ありがとうございます。 ZAPベクターインサート確認についてですが、パッケージング後に、ebikichiさんのおっしゃられているライゲーション効率を知るのと同様にBlue-Whiteでインサートのある程度の確認はできると思います。また、その後にwhiteの部分をさらにスクリーニングを続け、最終的にはin vivo Excisionによってファージミドを作成し、その際にPCRを用いたインサートの確認を行うのですが、前回この通りにWhiteだったのを行っていったのですが、最後のインサート確認PCRで全く入っていないという結果になってしまっていました。このため、その前段階での確認も必要なのではと思い、今回の質問になった経緯です。 また、インサートサイズについては、だいたい500から600ｂｐ位のものを予想していますが、実は目的のｃDNA自体の大きさがはっきりしていないのではっきりはわかりません（わかりにくい表現ですみません。つまりまだ未知のものをターゲットとしてライブラリーを作成しようとしているので…。） 多分ベクターの長さがだいたい600ｂｐ位であるということから、インサートが入っていれば泳動に差ができるのでは、という意見なのだと思うのですが…。 ややこしくなってしまって申し訳ありません。