ライゲーション（ベクターの構築）

質問

私は現在ベクターを作製しているのですが、どうも上手くインサート（2.5Kb）がベクターに入りません。今までは、同じベクターでも簡単に上手く行っていました。ライゲーションを行う前にCIAP処理やエタ沈後定量し濃度を確認するなど様々な方法をした後にライゲーションをしても上手くいきません。根気強くやるのはもちろんなのですが、同じことを何回やっても意味がないですし原因が分からないと納得いかず投稿しました。何か原因があるのでしょうか？また、何かほかに方法があるのでしょうか？まだこのような実験を始めて半年なので分からないことばかりです。何か思いあたる事がありましたら教えてください。お願いします。

回答No.3

atowaku

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回答No.2

sandaba

解決に必要な情報がほとんど無いので、あくまで一般論としてですが・・・

1. 先生か先輩院生か、誰かがあなたの指導担当者のはずです。まずはその人によく相談してください。指導者が気に食わないという理由でよその人にばかり相談する初心者がよくいますが、実験内容の詳細を知らない人からのアドバイスをつまみ食いしてうまくいくことはほとんどありません。生命科学の実験においては、うまくいく理由はひとつしかなく、うまくいかない理由は無数にあるからです（前者のみが教科書に書かれています）。そして相談するときは謙虚になってください。「今まではうまくいってたのに」なんて言葉が真っ先に出てくるようではダメです。それは問題を解決したいという心より、失敗を責められたくないと言う自己弁護の心です。あなたがそのような態度では、指導者も「君が何も悪くないと言い張るなら、もう一回やってみたら」としか答えようがないでしょう。

2. 実験するときは、日常生活におけるよりはるかに疑い深い態度が必要です。すべてを疑いましょう。水も試薬も機材も自分の技も。本当にとんでもないことがいろいろ起こります。私の経験では、ある日突然ライゲーションできなくなって、いろいろ調べたら制限酵素のバッファ内に藻が生えていた、なんてことがありました。対策の基本は、作り直す、新たに買う、うまくいっているもの（人間も含めて）を使わせてもらう、です。なお「他人が自分の実験を妨害しているのでは」と疑う必要はあまりないです。経験上、そういう申し立ては大抵本人が精神を患っています。

3. コントロールを取りましょう。先に書いたように、うまくいかない理由は無数にあるので、適切なコントロールを取ることによってのみ問題を切り分けることができます。たとえば、あなたの切り出したインサートは別のプラスミドには入らないでしょうか。逆に、同じ制限酵素サイトで全然違うインサート（周りの人から適当なものをもらってください）だったら入らないでしょうか。ライゲーションの系に問題があるのか、コンストラクト固有の問題なのかがわかります。

4. すべてが理詰めで説明できるわけではありません。大腸菌と言えども生物という極めて複雑な系を扱っているのですから必ずそういう部分はあります。うまくいかない場合は、その理由を追究するより回避したほうが早いことがあります。コンストラクションの手順をちょっといじってみてはいかがでしょうか。本質的には同じことしているのに（としか思えないのに）朝三暮四が何故か通用してしまうのがこの世界です。

お礼

ありがとうございました。自分自身色々見直すべき所もありそうです。
アドバイスを参考に原因を突き止めてがんばります。

回答No.1

teru-arai

まず、うまくいかないというのは実際にはどういう状況なんでしょうか？　学生がうまくいかないと言ってよく相談に来ますが、
うまくいかないにもずいぶんいろいろありますので。これだけで原因を狭めろと言われても困りますが・・。

普通は、ポジティブコントロールを同時並行で行います（できるだけ、うまくいってないインサートと同じような条件でやると
良いです）。コントロールがうまくいくなら、酵素、ヴェクター、コンピーテントセル、他同じ所は問題ないことになります。

　　そのインサート固有の問題かもしれません。インサートとヴェクターの比をもっと変えるか、あるいはインサートを作り替え
ると良いかもしれません。本の少しの作り替えでうまくいくこともあります。私はたいていPCRでインサートを作っていますが、
うまくとれない時に、プライマーを少しずらしたものに作り替えるとうまくいったりします。微妙なことが影響しているようです。

　　それから、ずいぶん昔、マーマルの転写因子のcDNAを大腸菌用のエクスプレッションヴェクターに組み込んでいたころの
話です。いくらやっても、組み込んだプラスミドが取れないことがありました。結局、その転写因子のDNA結合領域の部分
を削ったものを使ったら一発で取れました。DNA結合性のタンパク質は大腸菌に毒性が有ったのです。インサート
が大腸菌に毒性をもつ可能性もあります。

　　今思いつくのはそれくらいです。

お礼

ありがとうございました。アドバイスも頭に入れて色々試して、上手くいくようにがんばります。