- 締切済み
3者ライゲーション
３者ライゲーションでかなり苦戦しています。何か良い方法等ありましたら、ぜひアドバイスください。 ライゲーションキットはRapid DNA Laigation kit(ロシュ)を使用し、ベクター側をSacI/NotIで処理しています（AP処理済）。インサート一つ目はSacI/BlnIで、二つ目はBlnI/NotIサイトでのライゲーションです。すべてアガロースから切り出し、生成したものです。反応時間はまず、インサートのmixtureで16℃15min、ベクターを添加して24℃10minです。ベクター：インサートモル比を1：3：3で行ってみましたがコロニーが得られませんでした。 ベクター、インサートの消化はEPにより確認済み。にもかかわらず、ベクターのセルフが多発。
- 2810
- お礼率36% (4/11)
- 生物学
- 回答数6
- ありがとう数8
- みんなの回答 （6）
- 専門家の回答
みんなの回答
- AthlonXP
- ベストアンサー率20% (190/919)
切り出しにUVを使わないキットがあります。 それを使ってみると効率が上がるとのことです。 切り出す際DNA量がいるのが欠点ですが。
- geneticist12
- ベストアンサー率67% (701/1045)
壁を突破できたようで、よかったですね。 ＞短い断片のほうがＵＶの影響を受けにくいものなのでしょうか？ ピリミジンダイマーがランダムに生じるとすると、DNA長に比例して、分子内のどこかにピリミジンダイマーができる可能性が高まります。レプリコンとして、どこか一箇所でもピリミジンダイマーがあると悪影響がでるので、そういうことになるのではないでしょうか。
- momo22v
- ベストアンサー率0% (0/0)
three piece ligation やったことがあります。 そのときの方法です。 少し前のことなので、記憶があいまいな部分もあり、参考になるかどうか分かりませんが… インサート二種類とベクターが１：１：１になるように調整してやりました。 制限酵素siteはEco/Bam/Xhoです。 T4ligaseを使用して、インサートとベクターを分けることはせず、三つとも同じmixtureに一度にいれて１６℃オーバーナイトで反応させました。 なかなかの確率であがっていたように思います。
- geneticist12
- ベストアンサー率67% (701/1045)
さらに補足です。 インサートだけのライゲーションのあとで泳動でチェックしたことはありますか。ライゲーション反応は結構早いですから、すでにとんでもなく多数のフラグメントが重合してしまっているかもしれません。場合によっては、その段階で目的の産物を切り出してつかうとか。 むしろ最初からベクターこみでやったほうがいいかもしれません。
お礼
ご丁寧な返答有難うございました。インサートだけのライゲーションのあとの泳導はしたことなかったです。最初からベクター込みでやったことはありますが、改善されませんでした。現段階では、UV照射でのピリミジンダイマーが原因の可能性が強いですね。ピリミジンダイマーが形成されていることが判る方法があればいいのですが・・・。とにかく、その辺に特に注意して再度ベクターの調製からやってみたいと思います。有難うございました。
- geneticist12
- ベストアンサー率67% (701/1045)
UVがDNAに照射されると、たとえばTが並んでいるところで隣り合ったT同士が共有結合してしまうことがあります（チミンダイマー）。これを、鋳型に複製されると2塩基が、CだったかGだったか1塩基としてはたらき、フレームシフト変異の原因になったりします。生物にはダイマーを除去修復する機構があります。大腸菌では、この修復の過程でRecAが必要なのですが、宿主菌の多くはRecA-なので修復が完了できません。
- geneticist12
- ベストアンサー率67% (701/1045)
すべてということは、ベクターもですか？ 少量とって泳動しただけでは、切れ残りのcccとか、OCは見逃す可能性があります。ligation反応のときに、じつはno insertのプラスミドがコンタミしているのかも、 前にも書いたのですが、切り出しのときのUVでピリミジンダイマーができます。そうすると、切り出したDNAを泳動で確かめてOKで、ligationもうまくいっても、生えてきません。ここを気をつけるだけで、劇的に結果が違うことがありますです。 http://oshiete1.goo.ne.jp/kotaeru.php3?q=1385118
お礼
ご返答有難うございます。 ベクターもです。セルフが入る可能性はここで一番高くなると考え、シングルバンドが確認できるような濃度で泳導し、制限酵素による消化を、ついで過剰量を泳導して切れ残りのコンタミを確認しました。過剰量といってもウェルに乗る分なので果たしてソレで確認になったとは言いにくい面もありますが・・・。 ピリミジンダイマーとはどのような状況になるのですか？知識不足でお恥ずかしいのですが、お答え宜しくお願いします。
関連するQ&A
- ライゲーション→トランスフォーメーション
ライゲーション→トランスフォーメーションが上手くいきません． トランスフォーメーション後のプレートにはコロニーは沢山生えてきます．ネガティブコントロールとしてベクターのみでライゲーション→トランスフォーメーションするとプレートには殆どコロニーは生えてきません． しかし，コロニーを拾ってMiniPrepし，適当な制限酵素で切断したりしてアガロース電気泳動すると予想だにしないバンドが出てきます．２０個くらいに対し１個は予想されるところにバンドはくるのですがセルフです． ベクター（10 kbp）の方はBamH Iで制限酵素切断して，BAP処理をしています．インサート（2 kbp）はBgl II及びBamH Iで切断しています．Bgl IIとBamH Iの切断部位の相同性を利用したライゲーションです．濃度はベクターが0.03 pmolでインサートは0.3 pmolです． ライゲーション時間は１，３，１７時間試しましたが，全てダメでした． 大腸菌はJM109です． ライゲーションが上手くいっていないのか，それとも大腸菌の中で異常が起きているのでしょうか？
- ベストアンサー
- 生物学
- ライゲーションが上手くいきません
ベクターの構築をしてるのですが、 インサートが５ｋｂでなかなか上手く入ってくれません。 bluntと、５’突出末端でライゲーションしトラフォメ後、コロニーはでるのですが数も３０こくらいで、多くはありません。 N,C（ベクターのみ）はコロニーがでていないのでセルフライゲーションは多くないのですが、目的のインサートを含んだコロニーがないんです。どうしたら良いでしょうか？
- ベストアンサー
- 生物学
- ライゲーションがうまくいきません
目的遺伝子をTAクローニングしたのですが、その後の発現ベクターへの ライゲーションがどうしてもうまくいかず困っています。 インサートは約900bpで、ベクターはT7プロモーターのpET-9a(4341bp)です。 インサートとベクターを2種類の制限酵素(Nde1とBamH1)で5時間ほど処理し、 T4 ligaseを用いて14℃オーバーナイトでライゲーションしています。 ライゲーション後はBL21(DE3)pLysSを使用していますが、コロニーが全く発育しません。 DE3遺伝子保有株のため、IPTGも培地に添加しています。 制限酵素処理後、インサートも目的の長さのものが得られていますし、 電気泳動で確認する限り、切れ残りはないと思います。 制限酵素処理したベクターも未処理のものに比べ泳動されずらくなっているのが確認できるので 酵素処理で開環していることも確認できています。 インサートの開始コドンの読み取り枠もずれていませんし、 インサートもベクターも1μg超ぐらいの濃度でライゲーションを行ってるので、 量が少ないということも考えずらいです。(ベクター：インサート≒1mol：5molです。) 何か原因があるはずなのですが、思いつきません。 何でも教えて頂けると大変助かります。よろしくお願い致します。
- 締切済み
- 生物学
- XhoI-SphI のライゲーション
XhoIとSphIで1700bpのPCR産物をクローニングしようとしていますが、形質転換効率が非常に悪く、わずかに形質転換されたコロニーにもインサートは入っていません。 XhoIがPCR産物を分解しにくいという話はよく聞きますが、私は今まで別の遺伝子のクローニングに使って問題ありませんでした。今回のプライマーにも、上手くいっていた遺伝子をクローニングした時と同様、プライマーの制限酵素サイト外側に４塩基つけ、３７度二時間処理しました。 XhoIは、PCR産物の違いによって、同じ条件で処理しても切れたり切れなかったりするのでしょうか。 ライゲーションの方法自体に問題がないことはコントロールで確認した上で、ライゲーションの前後のDNAをアガロースゲルに流してみました。 ライゲーション前はベクターとインサートが問題なく見え、ライゲーション後は、バンドがいくつも見えました。いくつも見えたバンドの中には、 １．インサートのバンド ２．制限酵素処理したベクターのバンドよりやや小さいバンド ３．それからサイズのもっと大きいバンドが４本 でした。 一瞬、２．のバンドはきちんとライゲーションして環状になったものかと思ったのですが、このバンドは、使用したベクターよりはるかに明るいので、インサートが連なったものと考えるべきでしょうか。（因みに使ったインサートはベクターよりかなり多い）結局はこれを見ただけではライゲーションが上手くいっているのかわかりません。 XhoIを使われて同じような経験をされた方、どうぞアドバイスお願いします。
- 締切済み
- 生物学
- ライゲーションについて…。
またまたまたまた生物化学実験について質問です。 ベクターの構築方法についてです。 タンデムリピートベクターを作製しようとしているのですが、その過程で以下の行程があります。 一、ホス トベクターの断片とインサートの断片の片方のみをライゲーション。ライゲーション産物を泳動して精製 二、ライゲーション産物について制限酵素切断を行い、精製した後にライゲーション。ここで始めて環状となる。 以上の行程で目的ベクターの完成です。しかし、一、の精製時に目的のバンドが得られず、(5.4kbp辺りです)10kbp以上の部位にフニャフニャしたバンドが薄く出ていました。ここで質問なのですが、ライゲーション反応後にすぐに泳動したりすると、何か障害とかあるのでしょうか？エタ沈やフェノクロ抽出をせずに、そのままライゲーション液を電気泳動したので。 あと、うまくいかなかった理由として何かヒントのような助言をくださると助かります。ちなみに、使った試薬はニッポンジーンのT4DNAリガーゼです。 -詳細な説明- 最初にホストベクターをXbaIで切断します。ここにインサートDNAの片方の端をライゲーションで繋ぎます。インサートDNAの配列は [NheI-(インサート)-XbaI-ApaI]となっております。XbaIの切り口NheIの切り口は相補配列です。ライゲーション後はXbaIでライゲーション産物を切断して再びライゲーションを行い、DNAの環化を起こそうとしたのですが、難しいでしょうか？
- ベストアンサー
- 生物学
- ベクターの分子内ライゲーションについて。
インサートが組み込まれたベクターの不必要部分を制限酵素処理で除いた後、セルフライゲーションにより環状にして発現ベクターを作製したいと思っています。 ふと気になったのが、セルフライゲーションだけでなく、ベクター同士がライゲーションしてしまうこともあるのでは？ということです。大きな直鎖状DNA同士がライゲーションする可能性は気にしなくても大丈夫でしょうか？ ベクター同士が順方向でつながった場合、制限酵素処理では見分けがつかないような気がしますが、細胞に発現する際に何か問題が起こってきますでしょうか？ よろしくお願いいたします。
- ベストアンサー
- 生物学
- 平滑末端のライゲーション
平滑末端同士のライゲーションは効率が悪いのであまりやらないものなのでしょうか？ 上手な人や運がよいときはどのくらいの確率で成功するものなのですか？ 経験者の方教えてください。 ゲル切り出し後、SAP（promega製）を使って脱リン酸化をしてライゲーションをしたのですが、セルフライゲーション産物ばかり出てきます。 SAPの反応は説明書通り、37℃、15min、65℃、30minとやりました。 ベクターは10kbp、インサートは1kbpです。
- ベストアンサー
- 生物学
- 制限酵素サイトの異なるライゲーションについて
現在、あるベクターから別のベクターへ配列を移し替えようとしているのですが、ベクターとインサートの制限酵素サイトが合いません。ベクター側はEcoRIとBamHIで、インサート側はEcoRIとNotIで切り出したいと考えています。このような場合何かいい方法はありませんでしょうか？ 現在考えているのはベクター、インサート共に両側を平滑化する方法なのですが、向きが決まらないことと、現在まで平滑末端でのライゲーションの経験がなく、研究室内でも成功率が低いので他にいい方法がないかと思っています。 もしくはインサート側をＰＣＲで増やすことも考えたのですが、プライマー作製の時間を考えると、平滑化したほうが手っ取り早いのではないかと思っています。 また、現在まではライゲーションによって環状ＤＮＡを作ることしか行ったことがないのですが、上記のような末端を持つもの同士をライゲーションした場合、EcoRIのみで結合した直鎖状のＤＮＡが出来るのでしょうか？もしそうなのであれば、その後末端を平滑化してさらにライゲーションするという方法もありますよね？ 勉強不足で申し訳ありませんが、何かいい知恵をお持ちの方がいらっしゃいましたら拝借させていただけないでしょうか？
- 締切済み
- 生物学
お礼
geneticist12さん、 momo22vさん、アドバイス有難うございました。ＵＶの点に注意してベクターを再調整したところ、旨く入ったようです。（シークエンス確認はまだしていないので確定ではないですが。）ただ、ＤＮＡ断片の長さにより、ＵＶの影響に違いが有りそうな感じを受けましたが、短い断片のほうがＵＶの影響を受けにくいものなのでしょうか？何はともあれ、助かりました。有難うございました。